Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Robert Szulcek; Harm Jan Bogaard; Geerten P. van Nieuw Amerongen

doi:10.3791/51300

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Published: March 28, 2014

doi:

10.3791/51300

Robert Szulcek¹, Harm Jan Bogaard¹, Geerten P. van Nieuw Amerongen²

¹Department of Pulmonary Diseases,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, ²Department of Physiology,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center

Summary

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Abstract

Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing (ECIS) ist ein in vitro-Impedanz-Messsystem, das Verhalten der Zellen in adhärenter Zellschichten zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Zellen in speziellen Kulturkammern auf der gegenüberliegenden, kreisförmigen Goldelektroden entwickelt. Ein konstanter kleiner Wechselstrom zwischen den Elektroden und dem Potential an gemessen aufgebracht. Die isolierenden Eigenschaften der Zellmembran erzeugen einen Widerstand gegenüber dem elektrischen Stromfluss zu einer erhöhten elektrischen Potentials zwischen den Elektroden. Messung zellulärer Impedanz in dieser Weise ermöglicht die automatisierte Untersuchung der Zellhaftung, das Wachstum, die Morphologie, Funktion und Motilität. Obwohl die ECIS Messung selbst ist unkompliziert und leicht zu erlernen, ist die zugrunde liegende Theorie komplexer und Auswahl der richtigen Einstellungen und richtige Analyse und Interpretation der Daten ist nicht selbstverständlich. Doch eine klare Protokoll beschreibt die einzelnen Schritte von der experimentellenDesign Vorbereitung, Durchführung und Analyse des Experiments ist nicht verfügbar. In diesem Artikel werden die Grundmessprinzip sowie mögliche Anwendungen werden experimentelle Aspekte, Vorteile und Grenzen der ECIS-System diskutiert. Eine Führung für das Studium der Zellbindung vorgesehen, die Verbreitung und Vermehrung; Quantifizierung des Zellverhaltens in einer konfluenten Schicht in Bezug auf die Barrierefunktion, Zellbeweglichkeit, die Qualität der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Adhäsion und Quantifizierung der Wundheilung und Zellreaktionen auf vasoaktive Reize. Repräsentative Ergebnisse sind auf Basis menschlichen mikrovaskulären (MVEC) und humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) diskutiert, sind aber für alle anhaftenden wachsenden Zellen.

Introduction

ΩΩΩHere präsentieren wir Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing, als ECIS, spezifische Methode zur Messung und Analyse der Impedanzspektrum von adhärenten Zellen in Kultur ¹ bekannt. Ziel dieses Protokolls ist es, einen allgemein gültigen Leitfaden für die Nutzung dieser besonderen Art der Impedanz basierend zellulären Assays bieten und Protokolle für einige der wichtigsten Funktionen von der ständig wachsenden Zahl von Anwendungen. Der Fokus wird auf die Untersuchung der Zellproliferation, Barrierefunktion, Zellverbindungen und Zellbeweglichkeit sein.

Seit ECIS und die damit verbundenen Modell, um die Impedanzspektroskopie Daten in biologisch relevanten Parameter Transformation wurde in seiner jetzigen Form für die wissenschaftliche Gemeinschaft durch Giaever und Keese 1991 ² eingeführt wurde, wurde oft als ein System für die Messung des TEER (trans bezeichnet -epithelialen elektrischen Widerstand), die nicht korrekt. Die Unterschiede scheinen auf den ersten marginal, abersind für die Interpretation der Daten. Für klassische TEER-Messungen werden die Zellen auf durchlässigen Filter sich zu parazellulären Transportmechanismen, die von epithelialen tight junctions oder Endothelzellen Adhärenzverbindungen ³ dominiert werden, zu charakterisieren. Üblicherweise werden zwei Elektroden über und unter dem Filter positioniert ist verwendet, um eine Gleichstrom (DC) fließt über die Zellschicht und zwei anderen Elektroden, um den resultierenden Spannungsabfall messen, ⁴ anzuwenden. Der elektrische Widerstand wird unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes, das eine numerische Darstellung der Qualität der Zellbarriere ermöglicht berechnet.

ECIS folgt diesem Grundprinzip und erweitert ihn. Im ECIS System werden Zellen auf gegenüberliegenden, kreisförmigen Goldelektroden, die in der Unterseite des speziellen Zellkulturschalen eingebettet sind gewachsen. Die Anzahl der Elektroden pro Kulturvertiefung ist variabel, abhängig von der Anwendung und die Elektroden einen Standarddurchmesser von 250 &mgr; m, in einigen Fällen eine größere Gegenelektrodewird verwendet, um die Schaltung zu vervollständigen. ECIS verwendet einen konstanten Wechselstrom (AC) von 1 &mgr; A mit einer gegebenen Frequenz statt eines Gleichstrom. Die Impedanz wird von den entsprechenden Änderungen der Spannung (in mV) zwischen den Elektroden berechnet. ECIS bietet die Möglichkeit, die Impedanz über einen Bereich von Frequenzen frequenzabhängige zelluläre Eigenschaften, was mehrere Vorteile hat über TEER und werden im Detail in diesem Artikel erläutert studieren messen. Zunächst messen komplexe Impedanz ermöglicht Trennung der Gesamtimpedanz in Zellbarriere Widerstand und Zellenkapazität. Zusätzlich kann durch die Aufnahme von Daten auf mehreren Frequenzen und Anwenden eines mathematischen Modells, kann man zwischen junctional Impedanz (Dichtigkeit der Zell-Zell-Kontakte) und Impedanz durch Zell-Substrat-Wechselwirkungen (Abstand der basalen Zellmembran unterliegenden Matrix) sowie verursachte differen der Beitrag der Zellmembrankapazität. Zweitens kann die Zellproliferation und die Beweglichkeit beurteilt werden, da die Zells in direktem Kontakt mit den Elektroden. Drittens, Substrat und Elektroden sind ausreichend dünn, um für Hellfeld und Phasenkontrast-Mikroskopie zu ermöglichen.

Grundlagen der Impedanzmessungen: Die komplexe Impedanz

Die Grundlage für die Messung der elektrischen Impedanz der biologischen Objekte (z. B. Zellen) ist Ohmschen Gesetz ein EUP-Prinzip, das die Beziehung zwischen dem Widerstand (R) beschreibt, (I) und Spannung (U) in einer elektrischen Schaltung zu einer gegebenen Zeit (t).
Einsetzbar in Gleichstromkreis: R (t) = U (t) / I (t)

Bei der Arbeit im Wechselstromsystem, Strom und Spannung unterscheiden sich nicht nur in ihrer Amplitude, sondern auch in ihrer Phase (φ). Jetzt ist der Widerstand nicht mehr ausreicht, um diese Beziehungen zu beschreiben. Stattdessen wird die komplexe Impedanz (Z) oder in den meisten Fällen die Größe der Impedanz (| Z |) verwendet werden, welche die zuvor beschriebenen ohmschen Widerstand und Blindwiderstand (X), die WiederErgebnisse aus AC fließen durch die Kondensatoren und Induktivitäten Antreiben der Phasenverschiebung zwischen Spannung und Strom ^5.
Einsetzbar in Wechselstromkreis: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Bei der Durchführung von Impedanzmessungen an intakten Zellen, aufgrund der Eigenschaften der Membran wirken Zellen als eine Parallelschaltung von Widerstand und Kondensator. Hier Widerstand repräsentiert den Widerstand gegen Stromfluss, während die Kapazität (C) beschreibt die Trennung der elektrischen Träger in dem isolierenden Doppelschicht der Zellmembran, die Polarisation der Zelle bewirkt. X ist dabei durch die kapazitiven Eigenschaften der Zellmembran dominiert.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _Zelle) ^-1

Da X frequenzabhängige Variation der Messfrequenz ermöglicht Untersuchung der verschiedenen funktionellen und strukturellen Eigenschaften der Zelle. Die ECIS Gerät misst sowohl R und X, die eine Berechnungvon | Z |, C und φ.

Quantifizierung der gesamten Zellschichten mit Impedanzspektroskopie: Das elektrische Ersatzschalt.

Wie zuvor erläutert, wenn eine Zelle in ein elektrisches Feld gebracht wird, zeigt es Eigenschaften von passiven elektronischen Bauelementen. Wenn nun, statt einer einzelnen Zelle eine gesamte Zellschicht auf der Oberseite der Elektroden gewachsen und mit Zellkulturmedium ergänzt wird untersucht, das einfache Modell des Widerstands und des Kondensators muss auf einer gesamten elektrischen Netz erweitert werden. In diesem sogenannten Ersatzschaltwiderstand des Kulturmediums (R _M) und Kapazität (C _Geräte) und Widerstand (R _Electr) Charakterisierung der Elektroden / Elektrolyt-Wechselwirkung zu berücksichtigen ^3,6 ist.

Eine vereinfachte, allgemeine Beispiel einer solchen Ersatzschaltung für eine haft wachsenden Zellschicht kann in 1 gefunden werden. Der Vorteil eines solchen mathematischen aNSATZ auf ein biologisches System zu beschreiben, ist, dass diese Schaltungen ad libitum verfeinert und auf die spezifischen experimentellen Fragen, beispielsweise durch Berücksichtigung Impedanz von intrazellulären Organellen verursacht oder Einflüsse von Zell-Zell-(R _Junc) und Zell-Substrat-Adhäsion zu unterscheiden eingestellt werden (R _Sub) auf Gesamtimpedanz ^7,8. Dennoch das Ziel für die Modellierung sollte immer sein, die kleinste Anzahl von Elementen beschreiben alle Funktionen des gemessenen Impedanzspektrum um sinnvolle Zusammenhänge zu ermöglichen verwenden.

Fig. 1 ist. Schematische Darstellung des ECIS-System und Vertreter Ersatzschaltung für eine haftende Schicht wachsenden Zellen. A) Querschnitt eines ECIS Kultur auch. Die Zellen werden auf der Oberseite der Mess-und Gegenelektrode und eine wachsendewieder mit Kulturmedium bedeckt. Die Elektroden sind mit einem Lock-in-Verstärkers verbunden ist und ein Wechselstromsignal über einen 1 M &OHgr;-Widerstand angelegt, um eine Konstantstromquelle zu schaffen. Stimuli können direkt zu dem Kulturmedium bei jedem Zeitpunkt. B) ECIS misst die Summe der einzelnen Beiträge zu der Impedanz hinzugefügt werden. Widerstand des Kulturmediums (R _M) sowie Impedanz der Elektrode / Elektrolyt-Grenzfläche, die der Einfachheit halber als eine Parallelschaltung aus einem Widerstand (R _Geräte) und einem Kondensator (C _Geräte) und auch die elektrischen Eigenschaften vorgestellt verursacht der Zellmembran durch eine Parallelschaltung von Widerstand (R _Zelle) und Kapazität (C _Mem) beschrieben, müssen alle berücksichtigt werden. R _Zelle ist variabel, da sie abhängig von der Zelldurchlässigkeit gegenüber dem Strom ist. Die Ersatzschaltung erweitert und verfeinert ad libitum werden. Als Beispiel junctional (R _Junc) alssowie subendothelialen (R _Sub) Beständigkeit wurden an die Schaltung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Impedanz-Parameter und deren biologische Bedeutung

Die beiden von Impedanzmessungen abgeleitet direkte Parameter Widerstand und Kapazität der Zellen. Widerstand steht für Qualität und Funktion der Zellbarriere und berücksichtigt den Widerstand gegen Para-und transzellulären Stromfluss daher. Kapazität bietet ein Gesamtmaß der Elektrodenabdeckung. Die Besonderheit der ECIS ist, dass mit Hilfe von Ersatzschaltungen und Modellierung diese globale Parameter Einblicke auf viele weitere zelluläre Eigenschaften, einschließlich der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Adhäsionen, die später in diesem Artikel besprochen werden.

Vor dem Start: Experimentelle consideVerpflegung

Messaufbau – Der Aufbau besteht aus mehreren Komponenten: ECIS-Gerät mit Messelektronik, PC für die Datenerfassung; Array Halter für die 8 – oder 96-Loch-System, ECIS-Arrays und der Zellkultur der Wahl. Anordnungshalter muss in einem Inkubator platziert und mit dem ECIS Vorrichtung außerhalb des Inkubators angeschlossen werden. Der PC muss mit der ECIS-Software (1.2.123.0 14. Februar 2013) ausgerüstet und mit der ECIS-Gerät angeschlossen werden.

Array-Auswahl – Es gibt eine ständig wachsende Vielfalt der ECIS-Arrays, für mehrere Anwendungen. Die Standardfelder sind 8W1E und die 8W10E Arrays, die von 8 Kulturvertiefungen (durch W angegeben), die 1 oder 10 Messelektroden (durch E angedeutet), die jeweils zusammengesetzt sind. Eine große Gegenelektrode vervollständigt die Schaltung, aber die Impedanz bei der tatsächlichen Messung ⁶ im wesentlichen vernachlässigbar. Die Standard 8-Well-Array Halter kann ein Gastgeber zweirrays, was zu einer Gesamtzahl von 16 Kulturmulden. Die Goldelektroden 50 nm dick, mit einer isolierenden Schicht abgegrenzt und montiert entweder eine optisch klare Lexan Polycarbonat-Substrat oder eine Leiterplatte (PCB) sind. Die Leiterplatten-Arrays sind robuster und kostengünstiger. Die transparenten Folien ermöglichen eine leichte und Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Was zu beachten ist, dass der 1E-Array steigert Schwankungen des Widerstandssignals von Zellbewegungen verursacht und für die Wundheilung Studien erforderlich. Außerdem Einzelelektroden erlauben Korrelation der elektrischen und optischen Signalen. In der Multi-Elektroden-Arrays, wird das Signal über mehrere Elektroden gemittelt werden, die aufgrund der erhöhten Messbereich umfasst mehrere Zellen in der Messung begrenzt Vorspannung der Daten durch ungleichmäßige Inokulierung und Züchtung der Zellen und reduziert Unschärfe des Signals aufgrund von Zell Bewegungen. Daher sind die Multielektrodenarrays nützlich, um die Zellproliferation und der Barrierebildung zu untersuchen. NebenStandardanordnungen gibt es spezielle Anordnungen für die Anwendung der Scherspannung ⁹ zur Verfügung, um die Chemotaxis ¹⁰ zu studieren, Zellmigration und Proliferation als auch 96-Well-Platten für Hochdurchsatz-Screenings. Zum Schluss ist das Array verwendet werden stark von wissenschaftlichen Fragestellung und Zelltyp und sollte ausgewählt und sorgfältig geprüft werden.

Messfrequenz – Die Modellierung von Rb und Alpha (siehe Datenanalyse) erfordert Multifrequenzmessungen (MFT). Ansonsten kann die Impedanz über die Zeit bei einem Zelltyp spezifischen Frequenz (SFT) gemessen werden, mit dem Vorteil, dass die Daten mit einer höheren zeitlichen Auflösung erfasst werden. Die empfindlichsten Messfrequenz für einen bestimmten Zelltyp kann durch Frequenzscans gefunden werden. Beim Plotten Impedanz bzw. Widerstand gegen die Frequenz in einem Log-Log Graph der Frequenz, wo der Unterschied zwischen zellfreie und zellbedeckten Elektrode größten ist, ist die Frequenz, bei der die Zellen zu blockieren ter Strom am effektivsten. Im Falle von Endothelzellen (EC) diese Frequenz bei etwa 4 kHz.

Aussaatdichte – wie in jedem normalen zellbasierten Experiment Aussaatdichte hängt von der wissenschaftlichen Problem. Bei der Untersuchung von Adhäsion und Ausbreitung oder Barrierebildung sollte Endothelzellen mit einer hohen Dichte von 40.000-60.000 Zellen / cm ² ausgesät werden, um eine konfluente garantieren, stabile Barriere nach 48 Stunden. Wenn der Fokus des Experiments auf die Proliferation, sollte Endothelzellen mit einer niedrigen Dichte von etwa 2.000-10.000 Zellen / cm ² ausgesät werden.

Protocol

1. Herstellung von Mess-System Vorwärmen der Anordnungshalter in einem Inkubator auf 37 ° C vor dem Start des Experiments, um Kondensation zu verhindern. Füllen Sie Wasser Sarg des Inkubators mit destilliertem Wasser auf das Trocknen der Brunnen zu vermeiden. Führen alle Manipulationen an Zellen und-Arrays in einer Sterilbank unter sterilen Bedingungen. 2. Herstellung von Arrays und Inokulation der Zellen HINWEIS: Die ECIS Arrays müssen gereinigt und vor einem Versuch, stabilisiert werden, um die Elektrodendrift zu verhindern, wohl und Reproduzierbarkeit und Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Deshalb werden zwei Optionen zur Verfügung: A) Vorbehandlung der Elektroden mit L-Cystein und B) des Stabilisierungsfunktion der ECIS. Option A: L-Cystein ist als die konsequente Vorbehandlung empfohlen, aber vielleicht in einigen speziellen Fällen interagieren mit Protein coatings auf den Elektroden. Die vorgestellten Bände sind für Standard-8-Well-Arrays verwendet. Geben Sie 200 ul / 10 mM L-Cystein. Cystein reinigt und modifiziert die Elektrodenoberfläche eine hohe und reproduzierbare Elektrodenkapazität. Inkubieren 15 min bei Raumtemperatur (RT). Mit Reinstwasser (Typ 1) Waschen zweimal 500 ul /. Nicht verwenden Phosphat-Puffer, die mit der Adsorption einiger Proteine stören können. Vermeiden Sie auch Serum-haltigen Lösungen vor der Beschichtung, da der Goldoberfläche werden die ersten Makromolekülen in Kontakt gebracht zu adsorbieren. Mantel mit 200 ul / warmen 1% Gelatine. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Gelatine entfernen, aber keine Oberfläche trocken lassen. Dies kann die Elektroden beschädigen. Einmal mit Reinstwasser (Typ 1) waschen. Geben Sie 400 ul / komplette Zellkulturmedium (Serum, Antibiotika und Wachstumsfaktoren enthält alle). Slide-Array in Array Halter eind stellen Sie sicher, dass das Array ist so positioniert, dass die neun Gold-Quadrat-Pads sind ordnungsgemäß von den federbelasteten Pogo-Pins und fix Einstellschraube handfest kontaktiert. Seien Sie vorsichtig mit transparent-Arrays kann die Goldschicht leicht beschädigt werden. Öffnen Sie die Mess-Software-Setup, und drücken Sie anschließend prüfen im "Collect Data" Abschnitt, um einen schnellen Impedanzmessung der einzelnen gut. Die resultierenden Werte sind die Messung der Grundlinie und wird automatisch in den "Bemerkungen" gespeichert werden. Die Prüfung wird auch automatisch die Art der ECIS-Arrays verwendet zu bestimmen. Überprüfen Sie, ob die ausgewählten Arrays im Abschnitt "Nun Konfiguration". Die Array-Diagramm leuchtet grün für richtig angeschlossen Brunnen und rot für leere oder falsche angeschlossenen Brunnen. Dennoch, immer darauf achten, dass die Arrays korrekt in der Halterung platziert wurden. HINWEIS: Wenn die Reinigung und Beschichtung erfolgreich waren die 8W1E ECIS Arrays acapacitance von ca. 5 nF und 8W10E Arrays von 50 nF, der in einem Basiswiderstand von ungefähr 2.000 und 200 Ω ergibt, sind. Entfernen von Array-Halter aus. Samenzellen als Einzelzellsuspension in 400 &mgr; l / Vertiefung vollständigen Zellkulturmedium. Option B: Das Stabilisierungsfunktion der ECIS kann als Alternative oder in Kombination mit L-Cystein-Behandlung verwendet werden, und wenn Probleme mit Elektrodendrift oder große Unterschiede in wohl auch Widerstand und Kapazität auf. Führen Cystein-Behandlung (optional) und Vorstrich Elektroden mit Protein (optional). Geben Sie 200 ul / Komplettmedium in jede Vertiefung und legen Sie das Array im Array Halter. Offene Mess-Software-Setup, und drücken Sie anschließend prüfen, um das Array zu ermitteln richtig angeschlossen ist und erste Z, R zu messen, und C. Stabilisieren Sie die Elektroden durch Drücken <sTrong> Stabilisieren in der "Collect Data" Abschnitt. Die ECIS wird eine hohe Strom (ca. 3 mA), Hochfrequenz (64 kHz) Impuls, um die Elektroden zu reinigen gilt. Prüfen Sie Elektroden wieder. Kapazität erhöht werden sollte und Widerstandswerte sollten in einem vergleichbaren Bereich liegen. Wenn Kapazitäts-und Widerstandswerte sind immer noch nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie die Stabilisierung. Array entfernen aus der Halterung und impfen Zellen. 3. Einrichten Messsoftware und Datenkommunikation Platzieren der Anordnung in der Anordnungshalter, wie oben beschrieben. Offene Messsoftware und drücken Sie die Setup-Taste im "Collect Data" Abschnitt, um die Software auf den ECIS ECIS Instrument verbinden und führen ein weiteres gut kontrollieren. Überprüfen Sie, ob die ausgewählten Arrays im Abschnitt "Nun Konfiguration". Wählen Sie die Brunnen in der "Well CONFIGURAT gemessen werdenIonen-Abschnitt ". Wählen Sie den Messmodus aus den "Collect Data"-Optionen: Für eine Zeitreihe mit einer festen Frequenz, wählen Single Freq. / Zeit (SFT) und wählen Sie die Messfrequenz aus dem Dropdown-Menü. Für die Messung der Elektroden Berichterstattung und Modellierung von Rb und Alpha, wählen Sie Mehrere Freq. / Zeit (MFT). Die ECIS Gerät wird auf allen verfügbaren Frequenzen automatisch zu messen. Für Mikrobewegung (siehe Datenanalyse) wählen Schnelle Zeit sammeln (RTC) und stellen Messfrequenz und Sampling-Frequenz. Hier ist der Standard zeitliche Auflösung einer Probe pro Sekunde (1 Hz), aber Abtastfrequenz kann auch erhöht werden, um schnelle Änderungen der Impedanz bis zu 25 Hz (für die Z-Theta) zu verfolgen. Wichtiger Hinweis: RTC-Modus nur eine einzige gut wird gemessen. HINWEIS: Bei Mikrobewegungen in mehreren Brunnen anschließend gemessen werden müssen, gehen Sie zu Hilfe> Experte Symbolleiste anzeigen / Menüpunkte> Acquire> Multi-Well RTC. Geben Sie das Zeitlimit (hr) im Abschnitt Daten sammeln, die ECIS werden nun die ausgewählten Brunnen in numerischer Reihenfolge zu messen. Nach dem Start der Messung wird die Software bitten, die Anzahl der Zyklen angeben. Geben Sie den Wert, wie oft die Messung wiederholt werden muss. Für SFT und MFT, wählen Sie das Zeitintervall (s) zwischen den Messungen oder wenn Daten müssen so schnell wie möglich zu verlassen diese Option nicht erworben werden. HINWEIS: Um Daten die ECIS-Gerät verwendet einen Multiplexer, um von einem mit einer Mindest SFT Erfassungsrate von 0,25 s und 7,5 s für MFT wechseln auch zu einem anderen zu erwerben. Bedeutung das Intervall ist abhängig von der Anzahl der ausgewählten Wells und Frequenzen. Für Messungen an langsam vermehrenden Zellen oder eine einfache Aufzeichnung von Widerstand gegen die Zeit, verwenden Sie Abstand von 600 s oder mehr. Drücken Sie auf Start, benennen Sie die Datei und wählen Sie den Ort, um die Daten zu speichern. HINWEIS: Die Datei sollte nicht eine problem, da ECIS Daten werden in einer Art von Klartext-Format namens *. abp, die noch nie mit allen Messfrequenzen und die Anzahl der Brunnen ausgewählt hat mehrere hundert MB gespeichert. Stoppen Sie mit Finish ausgeführt. 4. Medium wechseln und Zellmanipulation Drücken Sie Pause, dies wird die Datenerfassung zu stoppen, aber auch weiterhin die experimentellen Uhr laufen. Entfernen Sie das Array aus der Halterung und manipulieren ihn unter einer Sterilbank (dh Änderung Medium). Zeigen Array wieder in der Halterung und klicken Sie entweder auf Verbindung prüfen oder Fortsetzen Experiment, um die Datenerfassung fortgesetzt. Die Mess-Software wird eine Zeitmarke in der Datenmenge zu platzieren. 5. Akute Stimulation während der Datenerfassung HINWEIS: Eine zweite Möglichkeit ist es, die Zellen während der Datenerfassung, um sofortige Änderungen folgen manipulieren. Dies ist nur möglich,, Wenn die Proben nicht steril sein muss im weiteren Verlauf des Experiments. Fügen Sie den Reiz direkt auf den Brunnen und stellen Sie sicher, mit einer 200 ul Pipette mischen vorsichtig. Mark Zeitpunkt manuell durch Drücken Mark und einen Kommentar hinzufügen. 6. Elektrische Verwundung HINWEIS: Die richtigen Einstellungen für den verwendeten Zelltyp ist der Schlüssel für elektrische Verwundung. Wenn Verwundung ist zu kurz, dies kann zu einer unzureichenden Entfernung der Zellen führen, während bei Verwundung ist zu lang und / oder grobe dies die Elektroden (vor allem auf den transparenten Arrays) beschädigen. Daher werden mehrere kurze Impulse Verwundung empfohlen. Für HUVEC zwei Kulturen 10-20 sec lang Verwundung Impulse von 5 V bei 60 kHz wurden jeweils optimale Verwendung der ECIS 1600R gefunden. In der Regel empfiehlt es sich, hohe Frequenzen> 20 kHz, um eine einheitliche hohe Felder über die Zellen zu erhalten und um Schäden an den Elektroden zu vermeiden. Führen Verwundung währendten eine aktive ECIS-Messung. Aktivieren Wound / elektroporieren-Setup, klicken Sie dann auf Wunde und füllen Sie die Zeit (sec), Wundspannung (V für 1600 R) oder Strom (uA für Z-und Z-Theta) und Frequenz (Hz). Die angezeigten Standardwerte werden auf den Typ von Array und ECIS Geräts. Wählen Sie die Brunnen in der Rubrik "Gut Konfiguration" gewickelt. Nur die Brunnen überprüft werden verwundet werden. Verzögerung Enable Bis Hour und füllen Sie die Verzögerungszeit, um die Verzögerung Wunde Funktion zu aktivieren. Diese Funktion kann jederzeit durch Drücken der Stop-oder manuell Anlegen einer Wunde gestoppt werden. Nur ein Befehl Verzögerung zu einer Zeit aktiv sein. Drücken Sie Aktivieren und klicken Sie auf OK in dem Pop-up-Fenster zu starten Verwundung. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand Signal fällt auf den Offset-Impedanz nach Verwundung, die Verwundung sonst wiederholen. 7. Datenanalyse </p> Datendarstellung und Export. Fertig Messung oder Lastdaten über Datei eingestellt -> Öffnen. Wählen Brunnen aus dem Fenster "Well-Konfiguration" angezeigt werden. Gruppe einzelnen Vertiefungen, um die durchschnittliche präsentieren. Wählen Sie Parameter, um von der oberen Symbolleiste (Z, R oder C) angezeigt werden. Wählen Sie Diagrammtyp aus der oberen Symbolleiste (T = Zeit, F = Frequenz, 3D = Wasserfall Blot). Grafik-Offset und Bereich definieren mit den Schiebereglern unter dem Diagramm-Fenster oder füllen Sie die exakten Werte in den benachbarten Kontrollen. Wählen Sie aus den Grund "Time-Series-Optionen" in der "Analyze"-Abschnitt, um die Standardabweichung führen, laufende Durchschnitt oder Normalisierung der Daten. Aktiviere Expert Toolbar im Hilfe-Menü für fortgeschrittene Operationen wie Nyuist Handlung und Fourier-Transformation. Verwenden Sie "Anzeigeoptionen" in der "Analyse" Abschnitt ra definierennge der x-und y-Achsen-und Export-Graphen. Exportieren Sie ausgewählte Daten in eine Excel-Datei über Datei -> Exportieren von Daten -> Um Excel (Selected) und verwenden Sie ein Drittanbieter-Software der Wahl für eine eingehende Analyse, Statistiken und Darstellung nach Bedarf. Modellierung von Rb und Alpha. HINWEIS: Für die Modellierung ist es empfehlenswert, eine zellfreie, mittlere sowie Referenz gefüllt zu verwenden. Fertig MFT Messung oder Last MFT-Datensatz. Wenn ein zellfreien Referenz gut ist Suche drücken Sie entweder den Referenzwert oder Set, um die Zelle frei Zeitpunkt manuell von "Freq. Scan Modellierung" im Abschnitt "Analyse" wählen automatisch auszuwählen. Wenn es keine zellfreien Referenz, importieren Sie einen Referenzwert aus einem anderen Datensatz. Öffnen Sie die Referenzdatensatz (stellen Sie sicher, dass die gleiche Array-und Mittel verwendet wurde) und verwenden Sie Suche oder Set, den Referenzwert zu wählen.Navigieren Sie dann zu den Messdaten und drücken Get. Wenn es keine zellfreien Referenzdatensatz zur Verfügung Verwendung der Werkseinstellung. Drücken Modell, um die Berechnungen zu starten. Modellierung kann einige Minuten abhängig von der Größe des Datensatzes zu nehmen. Berechnung der Mikrobewegung. Hinweis: Diese Berechnung ist nicht Teil der Mess-Software, sondern kann mit jedem Signalverarbeitungssoftware durchgeführt werden. Beenden RTC Messung oder laden RTC Datensatzes. Normalisieren von Daten der gemittelten Widerstand der gesamten Zeit errichtet. Brechen Sie Daten mit einer Länge von 256 Datenpunkten in Segmente gesetzt und reinigen jedes Segment durch ein Hanning-Fenster. Führen Sie einen 256-Punkte-Fourier-Transformation und mittlere resultierenden Frequenzspektren zu einer einseitigen 129-Punkt-Leistungsspektrum, um Rauschen zu minimieren und verbessert das biologische Signal. Plot Frequenz gegen Amplitude in einer log-log Grafik und anwendenLeast-Square-lineare Anpassung. Die Steigung der linearen Anpassung ist ein Maß der Gesamtrauschen in dem Signal und dadurch die Mikrobewegung der Zellen.

Representative Results

Ein Experiment ist ziemlich einfach und die Messung selbst ist vollautomatisch, aber wie es oft der Fall ist, sind richtige Analyse und Interpretation der Daten von entscheidender Bedeutung. In der repräsentativen Teil für die Interpretation der wichtigsten mittels Impedanzspektroskopie mit ECIS bereitgestellten Parameter ein Leitfaden zur Verfügung gestellt. Dies wird hilfreich sein, um zu entscheiden, für welche Art von wissenschaftlichen Problem ein ECIS-Messung kann nützlich und welche Parameter aufgezeichnet werden können. Eine typische experimentelle Auslese können in der Regel in einer Wachstumsphase nach der Zellimpfung und einem Plateau-Phase, wenn die Zellen Konfluenz erreichten aufgeteilt werden. Jede dieser Phasen liefert Informationen über die verschiedenen zellulären Eigenschaften. Eine repräsentative Messung ist in Fig. 2 gezeigt und in vier Unterphasen unterteilt, um A) Zelladhäsion zu analysieren, die Verbreitung und Vermehrung, B) Bildung einer Reifung EG Barriere, C) die Zellmigration nach der Erzeugung eines elektrischenal gewickelt ist, und D) die zelluläre Antwort auf die Stimulation mit dem vasoaktiven Mittel Thrombin. Phasenkontrast-und Immunfluoreszenzbilder wurden direkt von der Messelektrode während der verschiedenen Teilphasen erfasst, die Verbindung zwischen Elektrodenabdeckung, Zellstatus und aufgezeichnet Impedanzsignal zu veranschaulichen. Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation Jeder Zelltyp hat seine charakteristischen Haftung und Wachstumskurve, die durch Variieren Aussaatdichte, Beschichten mit extrazellulären Matrixproteinen oder anderen Stimuli manipuliert werden können. Eine der Hauptschwierigkeiten, die Prozesse zu untersuchen ist, zu unterscheiden zwischen Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation. Wegener et al 11. Gab eine detaillierte Beschreibung für die Verwendung einer Kombination aus Widerstand und die Kapazität zwischen diesen Parametern und in Fig. 3 wird deutlich, wie Widerstand und Kapazität einander ergänzen unterscheiden. Es ist wichtig,die Untersuchung der Adhäsion und Ausbreitung auf den Einfluss der Messfrequenz zu verstehen, weil hier das elektrische Feld bewirkt eine Polarisation der Zellmembran der Zellen in der Suspension 8, die den Strom ausschließlich um die Zellen Strömungskräfte. Wenn die Zellen legen sie beginnen, den Stromfluss durch die Verbreitung über die Elektrode und die Kapazität sinkt linear mit dem Anteil der Freifläche an der Elektrode (Teilfläche) zu beschränken. Somit kann die Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation besten quantifizieren, wenn die Aufnahme-Kapazität bei einer Frequenz höher als 40 kHz (Fig. 3B), wobei die Abnahme in der Kapazität ist direkt proportional zu der Elektrodenabdeckung. Alternativ Widerstand am empfindlichsten Messfrequenz ist ein direktes Maß für die Differenzierung und Reifung von Zellen in einer konfluenten Barriere (Abbildung 3A). Zusätzlich zu der Teilfläche, Wegener et al. Eingeführt beiden anderenParameter, um die Haftung und die Elektrodenabdeckung quantifizieren: t 1/2 (halbe maximale Kapazität), die die Zeit ist, bis 50% der Elektrode mit Zellen (3B, Einfügung) bedeckt, und die Steigung der Kurve der Kapazität (s, nicht gezeigt), wie die Rate der Zellausbreitung und Proliferation. Festigkeit als Maß für die Barrierequalität Widerstand ist der Teil der Impedanz, die Barriere Qualität und Funktion am besten beschreibt, weil es vernachlässigt kapazitiven Komponenten von Membran, Elektroden-und Medium. Hier wird der Begriff Barrierequalität und Durchlässigkeit nicht verwendet wird, da Durchlässigkeit per Definition nur von Zell-Zell-Kontakten. Widerstand ist jedoch durch die Fähigkeit der Zellen und ihrer Zell-Zell-und Zell-Matrix-Wechselwirkungen, den Stromfluss zu blockieren bestimmt. Entsprechend verschiedenen Zelltypen (Klone und Passagen) haben ihre spezifischen Widerstandswerte (4A). Obwohl Widerstand gibt einem viel clearer Vorstellung über die Zellbarriere, sollte der Impedanzsignal immer berücksichtigt werden. Modellierung von Rb und Alpha Die ECIS Software birgt ein besonderes Merkmal ist die Fähigkeit, zwei Parameter, die sich zwischen der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Adhäsion (Fig. 4B und 4C) unterscheiden zu modellieren. Rb (in Ohm x cm 2), ist der spezifische Widerstand der Zell-Zell-Kontakte, um den Stromfluss und damit ein umgekehrtes Maß der klassischen Durchlässigkeit. Hohe Rb bedeutet geringe Durchlässigkeit in Richtung des Stromflusses. Alpha (in Ohm cm x 0,5) ist ein Maß für die Impedanz Beiträge aus den Zellelektrodenverbindungen. Das Modell auf Zell-Zell-und Zell-Matrix-Kontakte Quantifizierung wurde durch Giaever und Keese eingeführt 1991 und basiert auf der Annahme, dass die Zellen kreisförmig sind bezogen, scheibenförmige Gegenstände, die eine isolierende Membran haben, schweben über der Elektrode und mit leitenden Elektrolyten gefüllt 2 . Dieisolierende Eigenschaft der Zellmembran lässt nur drei Wege für den Strom: a) zwischen ventralen Oberfläche der Zellen und der Elektrode, b) zwischen den Zell-Zell-Kontakte, und c) durch die Zellen (nur wahrscheinlich, wenn eine hohe Messfrequenz verwendet ). Eine detaillierte Herleitung und Erklärung kann in den Zeitungen von Lo et al 3,12 gefunden werden. Micromotion Es hat sich gezeigt, dass kleine Schwankungen in dem Widerstandssignal (4A) durch feine, zufällig Zellbewegungen in konfluenten Zellschichten sowie Zellen bewegen und Ausschalten der Elektrode in Kulturen mit geringer Dichte 2 gibt. Dieser Aspekt der ECIS von Lo und Opp beschriebenen Zeitkursdaten et al 13,14. Wird oft übersehen und am besten zu sehen, wenn die Messung mit den 1E-Arrays und an der empfindlichsten Frequenz für Para-und subzellulärer Strompfade zu berücksichtigen. Die Berechnung dieser Zelle verursacht Lärm (Mikrobewegung) ist nicht Teil des the Standard-Messsoftware, obwohl in der neuesten Version Fast-Fourier-Transformation (FFT) ist integriert. Aufzeichnungs RTC-Daten mit einer Abtastfrequenz von 1 Hz für 1 h bei 4 kHz eine ausreichende Auflösung für die Berechnung von EC Mikrobewegung. Diese Berechnung stellt einen einzelnen Wert und kann direkt für die statistische Analyse verwendet werden. Eine erweiterte Diskussion über die Verwendung der Frequenzanalyse für Mikrobewegungen kann an anderer Stelle 15 gefunden werden. Alternativ zur FFT-Analyse andere Strategien verwendet werden können, wie die Varianz der Inkremente. Varianz gegenüber kleinen Änderungen in der Mikrobewegung empfindlicher, aber aufgrund dieser Empfindlichkeit der Vergleich der einzelnen Experimenten wird schwierig. Die Pisten des Leistungsspektrums sind eine robuste Messung der Mikrobewegung (4D). Hier ist die Fläche unter der Kurve kann als die Menge der Mikrobewegung oder Lärm erzeugen die Zellen ersichtlich. Daher, je steiler die Steigung des Leistungsspektrums je kleiner die Fläche unter der Kurveund je kleiner die Mikrobewegung. Elektrische Wundheilungs Assay Um die Migration von Zellen zu untersuchen, werden in der Regel mechanische Wunden durch Kratzen Zellen von der Kulturplatte mit Pipettenspitzen, Schaber oder spezifischen Zell Briefmarken und folgen ihren Remigration mikroskopisch 16 angelegt. Dieses Verfahren hat den offensichtlichen Nachteil, dass die Größe des Arbeits variiert und ist normalerweise zu groß, um den Einfluß der Zellproliferation auf den Wundheilungsprozess zu vernachlässigen. Die Verwundung Funktion des ECIS verwendet eine Hochspannung, Hochfrequenzimpuls, um eine Zelle frei Elektrode erhalten und anschließend folgt Remigration von benachbarten Zellen, die Todeszellen (5A) zu ersetzen. Ein Vorteil dieser automatisierten Verfahren über Standard-, arbeitsintensiv Scratch-Assays ist, dass der ECIS erzeugt eine hoch reproduzierbare Wunde mit einem präzisen Durchmesser von 250 um, die innerhalb weniger Stunden geschlossen, um reine Migration zu studieren. Ferner ist der elektrische Impuls tunes nicht Proteinbeschichtung abgesondert und extrazelluläre Matrix zu entfernen. Unter der Annahme, dass die Zellen auf der Elektroden Migrieren Sie von allen Seiten, kann die Migrationsrate leicht durch Teilen gewickelt Radius von Zeit für den Wundverschluss 17 erforderlich berechnet. Als eine Alternative zur elektrischen Verwundung kürzlich die sogenannte Elektrozaun Verfahren eingeführt (nicht gezeigt). Hier hohe Strompulse zu verhindern Befestigung und Migration von Zellen auf den Elektroden nach der Inokulation. Die Zellen werden auf der Messelektrode wachsen und beginnen Migration nach innen, sobald die elektrischen Impulse ausgeschaltet sind. Der Vorteil der Elektrozaun über den Elektro Verwundung ist, daß die Elektrodenoberfläche nicht durch Zellwachstum oder die Zellentfernung, die wichtige Einflüsse von verschiedenen Beschichtungen auf die Zellmigration zu messen, ist geändert worden. Zellstimulation Neben der Untersuchung der Zellwanderung, wird Impedanzspektroskopie perfekt geeignetMessung der Wirkungen von Arzneimitteln und Toxinen auf Zellen. Fig. 5B stellt ein klassisches Stimulation / Inhibition Experiment, bei dem Thrombin wurde verwendet, um hyper Permeabilität im konfluenten EG Barriere induziert durch Kontraktion und Spaltbildung von Zellen, die als vorübergehende Widerstandsabfall äußert . Durch Vorinkubation mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 die meisten der Thrombin-Reaktion wird durch Absenken basalen Zellspannung 18 und Sperr Bildung von Stressfasern 19 vermindert. Dann wird der Rho-Kinase-Blocker wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Thrombin zusätzlich verwendet, was zu einer sofortigen und vollständigen Wiederherstellung des EG-Barriere. Hier ist der Vorteil einer kontinuierlichen Impedanzmesssystem zu akuten zellulären Antworten untersuchen offensichtlich. In regelmäßigen Endpunkt-Assays (z. B. Immunfluoreszenz-Färbung oder Makromolekül Durchgang), würde dies akuten Reaktion auf die verwendeten Blocker sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, zu erkennen und zu quantifizieren. Wichtig zu beachten ist, dass mit impedance Messungen der Durchlässigkeit für Ionen in Richtung Makromolekülen beschrieben und nicht. Bitte bis 20 Aman et al., Wo ein ausgezeichneter Vergleich zwischen ECIS-Messungen und Experimente Makromolekül Durchgang wird verwiesen. 2. Repräsentative Messung. MVEC wurden auf eine mit Gelatine beschichtete 8W1E Arrays mit einer niedrigen Keimdichte von 5.000 Zellen / cm 2 und MFT Aufzeichnung wurde über 10 Tage durchwachsen. Die Messung zeigt die unterschiedlichen Anzeigen eines ECIS Experiment: A) Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation, B) Bildung und Reifung einer konfluenten Zellbarriere, C) die Wundheilung nach der Anwendung eines elektrischen Wunde, d) Stimulation mit dem vasoaktiven Mittel Thrombin. Die beiden Pfeile zeigen Medium Getränke, die in Intervallen von 4 Tagen durchgeführt wurden und eine Vorstellung über die Empfindlichkeit der Messungen gegen mechanische Stimuli und Veränderungen in der Temperatur und pH-Wert. Die Bilder in der oberen Platte entspricht, und der Messung direkt von der Messelektrode erfasst. Das Phasenkontrastbild auf der linken Seite zeigt die Endothelzellen 24 Stunden nach der Inokulation ab, um die Elektrode abzudecken. Die Immunfluoreszenz-Bilder in der Mitte und auf der rechten Seite vorhanden F-Actin-Färbung des konfluenten Endothel-Schicht vor und nach Stimulation mit Thrombin (1 U / ml). Thrombin bewirkt Kontraktion der Endothelzellen durch die Bildung von sogenannten Stressfasern und die transiente Öffnung der Zwischenräume Endothelzellen (Pfeile und Bild Einsätze), in der ECIS Signal durch einen Abfall des Widerstands auf die Grundlinie erkennbar. Hier ist die Empfindlichkeit der Messung wird offensichtlich, und, wie Veränderungen in der Zellschicht korrelieren mit dem Impedanzsignal.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 3. Zellhaftung und-wachstum. MVEC vom selben Spender wurden mit drei unterschiedlichen Dichten auf Gelatine beschichtete 8W10E Arrays und das Zellwachstum wurde bei mehreren Frequenzen für 60 Stunden aufgezeichnet ausgesät. A) Die Widerstandswerte für die drei Bedingungen in ihre optimale Frequenz von 4 kHz zu messen, Barrierebildung. Alle drei Einsaatdichten wurde eine konfluente Barriere von ca.. 1200 Ω am Ende der Messung;. Jedoch die Proliferationsraten (Steigungen der Kurven) unterscheiden sich deutlich B) Messung der Kapazität bei 64 kHz bietet Einblicke auf die Adhäsion und Ausbreitung. Adhäsion ist die inentbindet den Plateau-Phase in der Kapazitätskurve (zwischen 2-8 h). Verbreiten, welche in einer linearen Beziehung zu der Elektrode Abdeckung ist, wird durch die Steigung der Kurve dargestellt und ist nach 10-30 Stunden in Abhängigkeit von der Aussaatdichte abgeschlossen. Der Zeitpunkt t 1/2 (die Hälfte der maximalen Deckung) können für statistische Analysen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Charakterisierung des Zusammenflussbarriere. Zwei MVEC Spendern mit unterschiedlichen Zahlen von Passagen (Durchgang 3 und 6) wurden auf mit Gelatine beschichtete 8W1E Arrays ausgesät und eine MFT Messung wurde für 30 h durchgeführt, um die EG-Schranke. A) Widerstand zu charakterisieren Messungen zeigen, dass die jüngere Spender 1 weist einen höheren Widerstand von ca.. 11.000 Ω im Vergleich zu den ca.. 7500 Ω der älteren Spender 2. V. Chr.) Die Modellierungsfunktionen des ECIS verwendet worden, um die Ursache für den geringeren Widerstand finden. Modellierung zeigte eine vergleichbare Zell-Zell-Interaktion und Rb bezeichnet einen geschwächten Zell-Matrix-Interaktion Alpha als eine mögliche Ursache. D) RTC wurde durchgeführt, um die Mikrobewegung Quantifizierung im konfluenten Zellschicht durch Fourier-Transformation, wobei die Fläche unter der Kurve ist proportional zur Mikrobewegung . Die Analyse der Spektren zeigt weniger Mikrobewegungen der älteren Spender 2 und dadurch unterstützen, was bereits von der Widerstandssignal (weniger Varianz) ausgegangen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> 5. Zellmigration nach Verwundung und elektrische Effekte von Thrombin Stimulation. Impedanz Aufnahmen wurden bei 4 kHz mit maximaler zeitlicher Auflösung durchgeführt. A) MVEC Spender 1 wurde in Durchgang 3 und Geber 2 in Durchgang 6 auf mit Gelatine beschichteten 8W1E Arrays und zur Konfluenz gezüchtet. Dann ein elektrisches Wunde wurde durch Anwendung von zwei 5 V bei 60 kHz Impulse mit einer Dauer von jeweils 20 Sekunden angelegt. Die jüngere Spender 1 zeigte bessere Wundheilungsfähigkeiten basierend auf einem schnelleren Wundverschluss (Migration, Steigungen der Kurven) und einen höheren Widerstand nach Verwundung im Vergleich zu den älteren Spender 2. B) HUVEC wurden auf mit Gelatine beschichtete 8W10E Arrays gewachsen. Bei Konfluenz werden die Zellen wurden 1,5 Stunden lang Serum ausgehungert durch den Austausch des kompletten Kulturmediums mit Basismedium plus 1% Humanserumalbumin (HSA). UnsAlter von Klar Medium mit HSA ist ein kritischer Schritt, da Serumkomponenten blockieren die Thrombin-Reaktion. Sobald ein stabiles Plateau Widerstand detektiert wurde, wurde Thrombin direkt in die Vertiefungen gegeben und vorsichtig mit einer Pipette 200 ul vermischt. Die maximale Wirkung von Thrombin ist nach 30 min, gekennzeichnet durch einen vorübergehenden Abfall des Widerstands auf die Grundlinie und einer ca. sichtbar. 30-50% geringeren Widerstand nach der Wiederherstellung. Die Zellen wurden entweder mit dem Rho-Kinase-Blocker Y-27632 für 30 min oder den Blocker vorinkubiert wurde 20, 30, oder 40 Minuten nach der Thrombin-Zugabe, die das Thrombin sofort wirksam vermindert aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen .

Discussion

ECIS ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für das Screening von Zelleigenschaften und das Verhalten als auch für die Quantifizierung der Wirkungen von bekannten und unbekannten Substanzen. Wodurch die Zellen unter Standardkulturbedingungen gehalten wird, kann die Impedanz kontinuierlich mit einer hohen zeitlichen Auflösung und überwacht, um optische Signale korreliert werden. So wird der optimale Zeitpunkt für die Zellmanipulationen auf der Basis der morphologischen und funktionellen Zellstatus ausgewählt werden. Leider kommt diese hohe Messauflösung mit dem Preis, dass kleine Veränderungen in der Temperatur, pH-Wert oder mechanische Stimulation von Zellen (Mediumwechsel) wird die Impedanzsignal unmittelbar beeinflussen.

Die Anwendung des kleinen Messstrom zu den Zellen macht die nicht-invasive Messung ECIS, zerstörungsfreie und markierungsfreie, sondern als Ergebnis nur passive bioelektrischen Eigenschaften gemessen werden können (keine Aktionspotentiale). Ein wesentliches Merkmal ist, daß eine Anzahl von Parametern kann der sein, aus einer einzigen Messung IVED, die Kombination der Informationen aus mehreren klassischen Tests wie Durchlässigkeit oder Wundheilung Assays. Hier insbesondere interessanter Aspekt ist, dass mathematisch modelliert Daten können verwendet werden, um Änderungen im Widerstand und Kapazität zu erforschen und beziehen sie verschiedene Zellstrukturen (z. B. Zell-Kontakte oder Zellmembran) werden. Wichtig zu beachten ist, dass der Impedanzspektroskopie liefert immer einen gemittelten Signale von allen Zellen, die auf der Sensorelektrode, die nicht für die Untersuchung von Einzelzellen zulässt und das mathematische Modell ist nur in konfluenten Zellschichten. Daher sollte Endothelzellen in der konfluenten Zustand für mindestens einen Tag vor der für die Modellierung verwendet werden, um reifen Zell-Adhäsionen und ruhenden Zellen zu gewährleisten statt. Ebenso sollten elektrische Wunden nur angewendet werden, um Zellschichten konfluent mit mehreren kurzen Verwundung Impulse mit hohen Frequenzen, um eine optimale Effizienz zu erreichen Verwundung und Beschädigung der Elektroden zu verhindern.

jove_content "> auf die maximale Menge an Informationen von einer ECIS Messung zu erhalten, wie in jedem Assay mehrere Parameter, wie die Kombination von Array-Substrat, Beschichtung und Aussaatdichte für die einzelnen Zelltyp müssen getestet und vor dem Experiment zu optimieren.

Eine wesentliche Einschränkung der ECIS ist, dass die Messung nicht liefern direkte Informationen auf molekularer Ebene. Somit sind ECIS Messungen gewöhnlich informativsten zu Beginn einer Versuchsreihe zu helfen assoziieren ist, ein Problem mit zellulären Strukturen oder Eigenschaften und erhebliche Eingabe für die Erzeugung einer Hypothese überprüfbar. Daher ist der modulare Aufbau der ECIS bietet ein breites Spektrum von Anwendungen mit der Möglichkeit für maßgeschneiderte Arrays. Die jüngsten Entwicklungen zeigen eine Reihe künftig auf hohen Durchsatz Impedanz-Screenings für die Zellproliferation und elektrische Verletzung und den Vormarsch der spezielle Strömungs Arrays für die Simulation der in vivo </em> Schubspannung mit unterschiedlichen Strömungsprofile.

Weitere Literatur
Bitte auf der Webseite von Applied Biophysics (www.biophysics.com) für Anwendungshinweise, Webinare und eine detaillierte Liste der Veröffentlichungen, die den gesamten ECIS Spektrum verwiesen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Charles Keese, Dr. Christian Renken, Christian Dehnert (Applied Biophysics Inc.) und Dr. Ulf Radler (ibidi GmbH) für ihre Beratung zu danken, zu helfen und die fruchtbaren Diskussionen während der Erstellung dieses Manuskripts. Weiterhin möchten wir an Jan van Bezu für seine hervorragende technische Unterstützung danken.

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Distributor Europe	Catalog Number	Comments/Description
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	71617	http://www.biophysics.com/products-ecisz0.php
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70004	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70001	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70010	http://www.biophysics.com/cultureware.php
L-Cystein	Merck Millipore	–	102838	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/l-cystein/MDA_CHEM-102838/p_GLOb.s1L7V8AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=L-cystein&BackButtonText=search+results
Gelatin	Merck Millipore	–	104070	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/gelatine/MDA_CHEM-104070/p_S7Wb.s1LadYAAAEWaOEfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=gelatine&BackButtonText=search+results
Bovine Thrombin	Merck Millipore	–	604980	http://www.merckmillipore.com/germany/life-science-research/thrombin-bovine-high-activity/EMD_BIO-604980/p__pmb.s1LNsYAAAEWS2IfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin	–		http://www.sanquin.nl/en/products-services/plasma-products/
Y-27632	Tocris Biosciences	–	1254	http://www.tocris.com/dispprod.php?ItemId=1382#.UbiFNNish8E
EGM-2 BulletKit	Lonza	–	CC-3162	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/endothelial-cell-growth-media-kits.aspx
Pen/Strep	Lonza	–	17-602E	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx

References

Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters. Exp. Cell Res. 250 (2), 576-580 (1999).
Wegener, J., Sieber, M., Galla, H. J. Impedance analysis of epithelial and endothelial cell monolayers cultured on gold surfaces. J. Biochem. Biophys. Methods. 32 (3), 151-170 (1996).
Pänke, O., Balkenhohl, T., Kafka, J., Schäfer, D., Lisdat, F. Impedance spectroscopy and biosensing. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 109 (11/2007), 195-237 (2008).
Wegener, J., Zink, S., Rösen, P., Galla, H. Use of electrochemical impedance measurements to monitor beta-adrenergic stimulation of bovine aortic endothelial cells. Pflugers Arch. 437 (6), 925-934 (1999).
Eker, B., Meissner, R., Bertsch, A., Mehta, K., Renaud, P. Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells. PloS ONE. 8 (3), (2013).
Nacke, T., Anhalt, M., Frense, D., Beckmann, D. Anwendungsmöglichkeiten der Impedanzspektroskopie in der Biotechnologie (Application of the Impedance Spectroscopy in the Biotechnology). Technisches Messen. 69 (1/2002), 12-18 (2002).
DePaola, , et al. Electrical impedance of cultured endothelium under fluid flow. Ann. Biomed. Eng. 29 (8), 648-656 (2001).
Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), (2012).
Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Exp. Cell Res. 259 (1), 158-166 (2000).
Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys. J. 69 (6), 2800-2807 (1995).
Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Monitoring motion of confluent cells in tissue culture. Exp. Cell Res. 204 (1), 102-109 (1993).
Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24 (8), 2625-2629 (2009).
Szulcek, R., Beckers, C. M. L., et al. Localized RhoA GTPase activity regulates dynamics of endothelial monolayer integrity. Cardiovasc. Res. 99 (3), 471-482 (2013).
Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
Krishnan, R., Klumpers, D. D., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 300 (1), 146-154 (2011).
Van Nieuw Amerongen, P. G., van Delft, S., Ma Vermeer, M., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87 (4), 335-340 (2000).
Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126 (23), 2728-2738 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

Automatically Generated