Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.
Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS) est un système de mesure d'impédance in vitro pour quantifier le comportement des cellules dans des couches de cellules adhérentes. À cette fin, les cellules sont cultivées dans des chambres de culture spéciales sur le dessus de opposées, des électrodes d'or circulaires. Un petit courant alternatif constant est appliqué entre les électrodes et le potentiel aux bornes est mesurée. Les propriétés isolantes de la membrane cellulaire créent une résistance à la circulation du courant électrique résultant en une augmentation de potentiel électrique entre les électrodes. Mesure de l'impédance cellulaire de cette manière permet l'étude automatisée de l'attachement cellulaire, la croissance, la morphologie, la fonction et la motilité. Bien que la mesure de l'ECIS lui-même est simple et facile à apprendre, la théorie sous-jacente est complexe et le choix des bons réglages et l'analyse et l'interprétation des données correcte n'est pas évident. Pourtant, un protocole clair décrivant les différentes étapes de l'expérimentationla conception de la préparation, la réalisation et l'analyse de l'expérience n'est pas disponible. Dans cet article, le principe de mesure de base ainsi que les applications possibles, des considérations expérimentales, les avantages et les limites du système de ECIS sont discutées. Un guide est prévu pour l'étude de la fixation des cellules, d'étalement et de la prolifération, la quantification du comportement des cellules dans une couche confluente, en ce qui concerne la fonction de barrière, la motilité cellulaire, de la qualité des adhérences cellule-cellule et cellule-substrat, et la quantification de la cicatrisation des plaies et réponses cellulaires à des stimuli vasoactifs. Les résultats représentatifs sont décrits sur la base de micro-vasculaire humain (MVEC) et ombilicaux cellules endothéliales humaines de veine (HUVEC), mais sont applicables à toutes les cellules en croissance adhérentes.
ΩΩΩHere nous présentons Cell-substrat électrique Impedance Sensing, connu comme l'ECIS, une méthode spécifique pour mesurer et analyser le spectre de cellules adhérentes en culture une impédance. L'objectif de ce protocole est d'offrir un guide général applicable à l'utilisation de ce type particulier de l'impédance en fonction des dosages cellulaires et fournir des protocoles pour certaines des fonctions clés du nombre sans cesse croissant d'applications. L'accent sera mis sur l'étude de la prolifération cellulaire, la fonction de barrière, les jonctions cellulaires, et la motilité cellulaire.
Depuis ECIS et son modèle associé pour transformer les données de spectroscopie d'impédance dans les paramètres biologiques pertinents a été introduit sous sa forme actuelle à la communauté scientifique par Giaever et Keese en 1991 2, il a souvent été considéré comme un système de mesure de TEER (trans -épithéliale de résistance électrique), ce qui n'est pas exact. Les différences apparaissent marginales au premier abord, maissont importants pour l'interprétation des données. Pour les mesures de TEER classiques, les cellules sont cultivées sur des filtres perméables à caractériser les mécanismes de transport paracellulaires, qui sont dominés par des jonctions serrées épithéliales ou endothéliales adhérentes jonctions 3. Communément, les deux électrodes placées au-dessus et en dessous du filtre sont utilisés pour appliquer un courant continu (DC) couler sur la couche de cellules et de deux autres électrodes afin de mesurer la chute de tension résultante 4. La résistance électrique est calculée en utilisant la loi d'Ohm, ce qui permet une description numérique de la qualité de la barrière cellulaire.
ECIS suit ce principe de base et l'étend. Dans le système de l'ECIS, les cellules sont cultivées sur des électrodes opposées, de l'or circulaires qui sont incorporés dans le fond de boîtes spéciales de culture cellulaire. Le nombre d'électrodes par la culture est ainsi variable dépend de l'application et les électrodes ont un diamètre standard de 250 um, dans certains cas, un plus grand contre-électrodeest utilisé pour compléter le circuit. ECIS utilise un courant alternatif constant (AS) de 1 uA avec une fréquence donnée à la place d'un courant continu. L'impédance est calculée à partir des variations correspondantes de la tension (en mV) entre les électrodes. ECIS offre la possibilité de mesurer l'impédance sur une plage de fréquences pour étudier les propriétés cellulaires dépendant de la fréquence, ce qui a plusieurs avantages par rapport TEER et seront expliquées en détail dans cet article. Tout d'abord, la mesure de l'impédance complexe permet de séparer l'impédance globale dans la résistance de la barrière de cellules et la capacité de la cellule. En outre, en prenant des données à des fréquences multiples et l'application d'un modèle mathématique, on peut distinguer entre l'impédance de jonction (raideur des contacts cellule-cellule) et de l'impédance causée par des interactions cellule-substrat (la distance de la membrane des cellules basales de la matrice sous-jacente), ainsi que la contribution de la capacité de la membrane cellulaire. Deuxièmement, la prolifération cellulaire et la motilité peuvent être évaluées, puisque la cellules sont en contact direct avec les électrodes. Troisièmement, le substrat et les électrodes sont suffisamment minces pour permettre le champ lumineux et microscopie à contraste de phase.
Base de mesures d'impédance: L'impédance complexe
La base de la mesure de l'impédance électrique d'objets biologiques (par exemple des cellules) est la loi d'Ohm, un principe de l'électro-technique de base, qui décrit la relation entre la résistance (R), le courant (I) et la tension (U) à un circuit électrique à un instant donné (t).
Applicable dans le circuit DC: R (t) = U (t) / I (t)
Lorsque l'on travaille dans le système de climatisation, le courant et la tension ne diffèrent pas dans leur amplitude, mais également dans leur phase (φ). Maintenant, la résistance n'est plus suffisant pour décrire ces relations. Au lieu de cela, l'impédance complexe (Z) ou, dans la plupart des cas, l'amplitude de l'impédance (| Z |) sont utilisés, contenant la résistance ohmique précédemment décrit, plus la réactance (X), qui resultats de courant alternatif s'écoule à travers les condensateurs et les inductances route du déphasage entre la tension et le courant 5.
Applicable dans le circuit AC: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2)
φ = arctan (X / R)
Pour effectuer des mesures d'impédance sur des cellules intactes, en raison des caractéristiques de leur membrane, les cellules agissent comme une connexion parallèle d'une résistance et d'un condensateur. Ici, la résistance représente l'opposition à la circulation du courant, tandis que la capacité (C), on décrit la séparation de porteuses électriques dans le bi-couche isolant de la membrane cellulaire qui provoque la polarisation de la cellule. Ainsi X est dominée par les propriétés capacitives de la membrane cellulaire.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C Cell) -1
Etant donné que X est dépendante de la fréquence, de la variation de la fréquence de mesure permet l'étude de différentes propriétés fonctionnelles et structurelles de la cellule. Les mesures de l'appareil de ECIS la fois R et X, qui permet de calculerde | Z |, C et φ.
Quantification des couches de cellules entières avec la spectroscopie d'impédance: Le circuit électrique équivalent.
Comme expliqué précédemment, quand une cellule est amenée en un champ électrique, elle montre les propriétés des composants électroniques passifs. Si maintenant, au lieu d'une seule cellule, une couche entière de cellules cultivées sur le dessus d'électrodes et complété par du milieu de culture cellulaire est étudié, le modèle simple de la résistance et du condensateur doit être étendue à l'ensemble d'un réseau électrique. Dans ce circuit que l'on appelle l'équivalent, la résistance du milieu de culture (R M) ainsi que la capacité (C Electr) et une résistance (R Electr) caractérisant l'interaction électrode / électrolyte doivent être envisagés 3,6.
Un, exemple général simplifié d'un tel circuit équivalent pour une couche de cellules adhérentes en croissance peuvent être trouvées dans la figure 1. L'avantage d'un tel mathématiquePPROCHE pour décrire un système biologique, c'est que ces circuits peuvent être affinés ad libitum et ajustés aux questions expérimentales spécifiques, par exemple en tenant compte de l'impédance causée par organelles intracellulaires ou de distinguer les influences de la cellule-cellule (R jonction), et adhérences cellule-substrat (R Sub) sur 7,8 globale d'impédance. Néanmoins, le but de la modélisation devrait toujours être d'utiliser le plus petit nombre d'éléments décrivant toutes les caractéristiques du spectre d'impédance mesurée pour permettre des corrélations significatives.
Figure 1. Schéma du système de l'ECIS et circuit équivalent représentant une couche de cellules en croissance adhérentes. A) de la section de la Croix d'une culture de l'ECIS bien. Les cellules sont de plus en plus au-dessus de détection et contre-électrode et unere recouvert de milieu de culture. Les électrodes sont reliées à un amplificateur lock-in et un signal de courant alternatif est appliqué par l'intermédiaire d'une résistance de 1 MQ pour créer une source de courant constant. Stimuli peuvent être ajoutées directement au milieu de culture à tout moment dans le temps. B) des mesures d'ECIS la somme de toutes les contributions individuelles à l'impédance. Résistance du milieu de culture (R M) ainsi que l'impédance causée par l'interface électrode / électrolyte, qui est pour plus de simplicité présentés comme une combinaison en parallèle d'une résistance (R Electr) et un condensateur (C Electr), ainsi que les propriétés électriques de la membrane cellulaire, décrite par un montage en parallèle d'une résistance (R cellulaire) et la capacitance (C Mem), doivent tous être pris en considération. R cellulaire est variable, car elle dépend de la perméabilité des cellules en direction du courant. Le circuit équivalent peut être étendu et affiné ad libitum. A titre d'exemple de jonction (R Junc) commeainsi que la résistance sous-endothélial (R Sub) ont été ajoutés au circuit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
paramètres d'impédance et leur signification biologique
Les deux paramètres les plus directs dérivées de mesures d'impédance sont la résistance et la capacité des cellules. Résistance représente la qualité et la fonction de la barrière de la cellule et prend en considération la résistance à l'égard de para-et de la circulation du courant trans-cellulaire donc. Capacité fournit une mesure globale de la couverture de l'électrode. La particularité de l'ECIS est que, avec l'aide de circuits équivalents et la modélisation de ces paramètres globaux donnent un aperçu sur de nombreuses propriétés plus cellulaires, y compris les adhésions cellule-cellule et cellule-substrat, qui seront discutées plus tard dans cet article.
Avant de commencer: considé expérimentalevivres
configuration de la mesure – La configuration se compose de plusieurs éléments distincts: l'appareil ECIS avec l'électronique de mesure; PC pour l'acquisition de données, support de tableau pour le 8 – ou système à 96 puits; tableaux ECIS et de la culture cellulaire de choix. Le porte-matrice doit être placée dans un incubateur et relié au dispositif de ECIS l'extérieur de la couveuse. Le PC doit être équipé du logiciel de l'ECIS (1.2.123.0 du 14 Février 2013) et relié au dispositif de l'ECIS.
sélection Array – Il ya une variété sans cesse croissante de tableaux ECIS, conçus pour de multiples applications. Les réseaux classiques sont la 8W1E et les matrices de 8W10E, qui sont composées de 8 puits de culture (indiquées par W) comprenant une ou 10 électrodes de mesure (indiqués par E), respectivement. Un grand contre-électrode complète le circuit, mais son impédance est essentiellement négligeable dans la mesure proprement dite 6. Le titulaire du tableau 8 puits standard peut accueillir deux unerrays, résultant en un nombre total de 16 puits de culture. Les électrodes en or sont de 50 nm d'épaisseur, délimitée par un film isolant et montées de part et d'un substrat de polycarbonate Lexan optiquement clair ou une carte de circuit imprimé (PCB). Les tableaux contenant des BPC sont plus robustes et rentables. Les lames transparentes permettent de microscopie optique et d'immunofluorescence. Ce qu'il faut considérer, c'est que le tableau 1E améliore les fluctuations du signal de résistance causé par les mouvements cellulaires et est nécessaire pour les études de cicatrisation des plaies. En outre, les électrodes individuelles permettent corrélation des signaux électriques et optiques. Dans les réseaux d'électrodes multiples, le signal est moyenné sur plusieurs électrodes, qui en raison de la surface augmentée de mesure comprend plus de cellules dans la mesure, limite le biais des données par inoculation inégale et la croissance des cellules et réduit le flou du signal due à la cellule motions. Par conséquent, les matrices d'électrodes multiples sont utiles pour étudier la prolifération cellulaire et la formation de la barrière. À côté detableaux standard, il ya des tableaux spéciaux pour l'application de la contrainte de cisaillement 9, pour étudier la chimiotaxie 10, la migration cellulaire et la prolifération ainsi que des plaques à 96 puits pour les projections à haut débit. Pour conclure, le tableau doit être utilisé dépend fortement question scientifique et le type de cellule et doit être sélectionné et testé avec soin.
fréquence de la mesure – La modélisation de Rb et alpha (voir l'analyse de données) nécessite des mesures de fréquences multiples (MFT). Sinon impédance peut être mesurée au cours du temps à une fréquence spécifique de type cellulaire (SFT), avec l'avantage que les données peuvent être recueillies avec une résolution temporelle plus élevée. La fréquence de mesure plus sensible pour un type de cellule spécifique peut être trouvée par des balayages de fréquence. Lors du traçage impédance respectivement résistance fonction de la fréquence dans un log-logarithmique de la fréquence où la différence entre le libre-cellule et cellule-électrode enrobée est la plus grande est la fréquence à laquelle bloquent les cellules Til courant le plus efficacement possible. Dans le cas des cellules endothéliales (CE) cette fréquence est d'environ 4 kHz.
Densité de semis – Comme à chaque densité régulière expérience ensemencement à base de cellules dépend du problème scientifique. Lorsque l'on étudie l'adhérence et d'étalement ou de la formation de la barrière, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une densité élevée de 40.000-60.000 cellules / cm 2 pour garantir un confluentes, barrière stable après 48 heures. Si la mise au point de l'expérience est de prolifération, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une faible densité d'environ 2.000-10.000 cellules / cm 2.
ECIS est un excellent outil pour le dépistage des propriétés et le comportement cellulaire ainsi que pour la quantification des effets des substances connues et inconnues. Ainsi les cellules sont maintenues dans des conditions de culture standard, impédance peut être contrôlée en permanence avec une haute résolution temporelle et corrélées à des signaux optiques. De cette façon, le point de temps optimal pour les manipulations de cellules peut être choisie sur la base de l'état morphologique et fonctionnelle cellulaire. Malheureusement, cette résolution de mesure élevée est livré avec le prix que les petites variations de température, le pH ou la stimulation mécanique des cellules (changement de milieu) auront une influence sur le signal d'impédance immédiatement.
L'application de la faible courant de mesure pour les cellules rend la mesure non invasive de l'ECIS, non destructive et sans étiquette, mais à la suite seulement les propriétés bioélectriques passive peut être mesurée (pas de potentiels d'action). Un élément clé est que un certain nombre de paramètres peut être der Ived partir d'une seule mesure, en combinant les informations provenant de plusieurs essais classiques, comme la perméabilité ou des analyses de la cicatrisation des plaies. Voici l'aspect particulier intéressant est que les données mathématiquement modélisés peuvent être utilisés pour explorer les changements de la résistance et de la capacité et les orienter vers les structures cellulaires distinctes (par exemple cellulaires contacts ou la membrane cellulaire). Est important de noter que la spectroscopie d'impédance fournit toujours un signal moyenne de toutes les cellules sur l'électrode de détection, ce qui ne permet pas d'études sur les cellules simples et aussi le modèle mathématique est valable uniquement dans les couches de cellules confluentes. Par conséquent les cellules endothéliales doivent avoir lieu dans l'état de confluence pour au moins un jour avant utilisé pour la modélisation d'assurer cellulaires adhérences matures et les cellules au repos. De même, les blessures électriques ne doivent être appliquées à confluentes couches cellulaires en utilisant des impulsions multiples blessantes courtes avec des fréquences élevées, pour atteindre l'efficacité optimale blessures et éviter d'endommager les électrodes.
jove_content "> Pour obtenir la quantité maximale de l'information à partir d'une mesure de l'ECIS, comme dans chaque essai, plusieurs paramètres tels que la combinaison d'un substrat de matrice, le revêtement et la densité d'ensemencement pour le type de cellule individuelle doivent être testées et optimisées avant d'une expérience.Une limitation importante de l'ECIS est que la mesure ne fournit pas d'information directe sur le niveau moléculaire. Ainsi mesures ECIS sont généralement plus informative au début d'une série d'expériences pour aider à associer un problème scientifique avec des structures ou des propriétés cellulaires et de fournir des données importantes pour la génération d'une hypothèse testable. Par conséquent, la conception modulaire de l'ECIS fournit un large éventail d'applications avec la possibilité pour Tailor Made tableaux. Les derniers développements de tableau indiquent un avenir accent sur haut débit projections d'impédance pour la prolifération cellulaire et la blessure électrique et l'avance des tableaux de flux spéciaux pour la simulation in vivo </em> cisaillement avec des profils de flux différents.
Documentation supplémentaire
S'il vous plaît se référer également à la page Web de la biophysique appliquées (www.biophysics.com) pour les notes d'application, des webinaires et une liste détaillée des publications couvrant l'ensemble du spectre ECIS.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Charles Keese, le Dr Christian Renken, Christian Dehnert (Applied Biophysique Inc.) et le Dr Ulf Radler (ibidi GmbH) pour leurs conseils, l'aide et les discussions fructueuses lors de la préparation de ce manuscrit. En outre, nous tenons à remercier Jan van Bezu pour son excellent soutien technique.