يستعرض هذا البروتوكول الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار، وهي طريقة لتسجيل وتحليل الطيف مقاومة من الخلايا الملتصقة لتقدير حجم مرفق الخلية، والانتشار، حركية، والاستجابات الخلوية للمؤثرات الدوائية والسمية. وأكد الكشف عن نفاذية البطانية وتقييم خلية خلية وخلية الركيزة الاتصالات.
الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS) هو نظام قياس مقاومة في المختبر لتحديد سلوك الخلايا داخل طبقات الخلايا الملتصقة. تحقيقا لهذه الغاية، وتزرع الخلايا في غرف خاصة الثقافة على رأس الخصم أقطاب الذهب دائرية. يتم تطبيق صغيرة بالتناوب تيار مستمر بين الأقطاب والمحتملة عبر يقاس. خصائص العزل من غشاء الخلية إنشاء المقاومة تجاه تدفق التيار الكهربائي مما أدى إلى زيادة الجهد الكهربائي بين الأقطاب. قياس مقاومة الخلوية في هذه الطريقة تسمح للدراسة الآلي للمرفق الخلية، والنمو، مورفولوجيا، وظيفة، والحركة. على الرغم من أن قياس ECIS نفسها هي واضحة وسهلة التعلم، نظرية الأساسية هي معقدة واختيار الإعدادات الصحيحة والتحليل الصحيح وتفسير البيانات ليست واضحة بذاتها. حتى الآن، وبروتوكول واضح واصفا الخطوات الفردية من التجريبيةتصميم لإعداد وتحقيق، وتحليل التجربة غير متوفر. في هذه المقالة مبدأ القياس الأساسية، فضلا عن التطبيقات الممكنة، وتناقش الاعتبارات التجريبية، ومزايا وقيود النظام ECIS. يتم توفير دليل لدراسة مرفق الخلية، ونشر وانتشار؛ الكمي للسلوك الخلية في طبقة متموجة، فيما يتعلق ظيفة الحاجز، حركية الخلية، ونوعية الخلايا خلايا والخلية الركيزة التصاقات؛ النوعي والكمي لالتئام الجروح و الاستجابات الخلوية للمؤثرات فعال في الأوعية. وتناقش نتائج ممثلة على أساس الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان (MVEC) والخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVEC)، ولكن لا ينطبق على جميع الخلايا المتنامية ملتصقة.
ΩΩΩHere نقدم الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة الاستشعار، والمعروفة باسم ECIS، وهي طريقة محددة لقياس وتحليل الطيف مقاومة من الخلايا الملتصقة في الثقافة 1. والهدف من هذا البروتوكول هو تقديم دليل المطبقة عموما لاستخدام هذا نوع معين من مقاومة مقرها المقايسات الخلوية وتوفير بروتوكولات لبعض الوظائف الرئيسية من عدد متزايد باستمرار من التطبيقات. سيكون التركيز على دراسة تكاثر الخلايا، وظيفة الحاجز، تقاطعات الخلية، والحركة الخلية.
منذ أن تم عرضه ECIS ونموذج المرتبط به لتحويل البيانات مقاومة الطيفي في المعايير ذات الصلة بيولوجيا في شكلها الحالي إلى المجتمع العلمي من خلال Giaever وKeese في عام 1991 2، وغالبا ما يشار إليها باسم نظام لقياس طير (العابرة الظهارة المقاومة الكهربائية)، وهي ليست دقيقة. الخلافات الهامشية يبدو في البداية، ولكنمهمة لتفسير البيانات. لقياسات طير الكلاسيكية، وتزرع الخلايا على مرشحات قابلة للاختراق لتوصيف آليات النقل paracellular، التي يسيطر عليها منعطفات ضيقة الظهارية أو الملتصقة البطانية تقاطعات 3. عادة، يتم استخدام قطبين وضعه فوق وتحت التصفية لتطبيق تيار مباشر (DC) تدفق أكثر من طبقة الخلايا وقطبين أخرى لقياس انخفاض الجهد الناتج 4. يتم حساب المقاومة الكهربائية باستخدام قانون أوم، الذي يسمح لوصف العددية للجودة حاجز الخلية.
ECIS يتبع هذا المبدأ الأساسي، ويمتد ذلك. في نظام ECIS، وتزرع الخلايا على معارضته، أقطاب الذهب الدائرية التي هي جزء لا يتجزأ في الجزء السفلي من الأطباق خلية ثقافة خاصة. عدد من الأقطاب الكهربائية في الثقافة هو أيضا متغير، يعتمد على تطبيق والأقطاب ويبلغ قطرها 250 ميكرون مستوى، وفي بعض الحالات أكبر عداد كهربائييستخدم لاستكمال الدائرة. يستخدم ECIS على التيار المتردد المستمر (AC) من 1 أمبير مع تردد معين بدلا من التيار المباشر. يتم حساب مقاومة من التغييرات المقابلة في الجهد (في السيارات) بين الأقطاب. ECIS توفر إمكانية لقياس مقاومة على مجموعة من الترددات لدراسة الخصائص الخلوية تعتمد تردد، والتي لديها العديد من المزايا أكثر من طير وسيتم شرحها بالتفصيل في هذا المقال. الأولى، وقياس مقاومة معقدة تسمح فصل مقاومة الشاملة في مقاومة الجدار الخلوي والسعة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال اتخاذ البيانات على ترددات متعددة وتطبيق نموذج رياضي، يمكن للمرء أن يفرق بين مقاومة صلي (ضيق من الاتصالات خلية خلية) ومقاومة الناجمة عن التفاعلات الخلية الركيزة (المسافة من غشاء الخلية القاعدية للمصفوفة الكامنة)، وكذلك مساهمة السعة غشاء الخلية. الثانية، تكاثر الخلايا وحركية يمكن تقييم، لأن الخليةو هي في اتصال مباشر مع الأقطاب. الثالث، والركيزة أقطاب هي رقيقة بما فيه الكفاية للسماح لحقل مشرق وعلى النقيض من المرحلة المجهري.
أساس القياسات مقاومة: مقاومة ومعقدة
أساس لقياس المعاوقة الكهربائية من الكائنات البيولوجية (مثل الخلايا) هو قانون أوم، وهو الكهربائية التقنية المبدأ الأساسي، الذي يصف العلاقة بين المقاومة (R)، التيار (I) والجهد (U) في الدائرة الكهربائية في وقت معينة (ر).
المعمول بها في العاصمة الدائرة: R (ر) = U (ر) / I (ر)
عند العمل في نظام التيار المتردد، التيار والجهد تختلف ليس فقط في السعة، ولكن أيضا في مرحلة من (φ). الآن، ومقاومة لم يعد كافيا لوصف هذه العلاقات. بدلا من ذلك، مقاومة المعقدة (Z) أو في معظم الحالات ضخامة مقاومة (| Z |) تستخدم، التي تحتوي على مقاومة أومية الموصوفة سابقا بالإضافة إلى مفاعلة (X)، والتي أعيدsults من AC تتدفق من خلال المكثفات والمحاثات قيادة مرحلة التحول بين الجهد والتيار 5.
المعمول بها في الدائرة AC: | Z (و) | = √ (R 2 + X) و (2)
φ = وظل الزاويه القوسي (X / R)
عند تنفيذ قياسات مقاومة على خلايا سليمة، ويرجع ذلك إلى خصائص الغشاء، والخلايا بمثابة اتصال موازية المقاوم ومكثف. هنا، المقاومة يمثل المعارضة لتدفق الحالية، في حين أن السعة (C) يصف الفصل بين الناقلين الكهربائية في العزل ثنائية الطبقات من غشاء الخلية الذي يسبب الاستقطاب من الخلية. وبذلك يهيمن X من خصائص بالسعة من غشاء الخلية.
X (و) ≈ (2 * بي * و * C الخليوي) -1
منذ العاشر هو تردد المعالين، اختلاف وتيرة قياس تمكن من دراسة مختلف الخصائص الوظيفية والهيكلية للخلية. التدابير جهاز ECIS كل من R و X، مما يسمح للحسابمن | Z |، C وφ.
قياس طبقات الخلية بأكملها مع مقاومة الطيفي: الدائرة يعادل الكهربائية.
كما هو موضح سابقا، عندما يتم إحضارها خلية في مجال كهربائي، لكنه يظهر خصائص المكونات الإلكترونية السلبي. إذا الآن، بدلا من خلية واحدة، يتم التحقيق فيها طبقة الخلية بأكملها نمت على رأس الأقطاب وتستكمل مع خلية ثقافة المتوسط، نموذج بسيط من المقاوم ومكثف يحتاج إلى أن تمتد إلى الشبكة الكهربائية بالكامل. في هذا ما يسمى دائرة ما يعادلها، مقاومة ثقافة المتوسط (ميد R)، وكذلك السعة (C إلكترونيات) والمقاومة (R إلكترونيات) التي تميز التفاعل الكهربائي / بالكهرباء تحتاج إلى النظر فيها 3،6.
A، مثلا عامة مبسطة من هذه الدائرة ما يعادلها للحصول على طبقة الخلايا الملتصقة المتزايدة يمكن العثور عليها في الشكل 1. ميزة مثل هذا والرياضيةpproach لوصف النظام البيولوجي هو أن تلك الدوائر يمكن أن يتم تكريره بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية وتعديلها على الأسئلة التجريبية محددة، على سبيل المثال من خلال النظر في مقاومة التي تسببها العضيات الخلوية داخل أو للتمييز تأثيرات خلية خلية (R Junc) والتصاقات خلية الركيزة (R الفرعية) على 7،8 مقاومة الشاملة. مع ذلك الهدف لنمذجة ينبغي أن يكون دائما إلى استخدام أقل عدد من العناصر التي تصف جميع ملامح الطيف مقاومة قياس للسماح الارتباطات ذات مغزى.
الشكل 1. التخطيطي للنظام ECIS وممثل الدائرة المكافئة لطبقة الخلايا المتنامية ملتصقة. أ) عبر قسم من ثقافة ECIS جيدا. الخلايا تنمو على رأس الاستشعار عن بعد ومكافحة الكهربائي وإعادة مغطاة ثقافة المتوسط. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت للانغلاق ويتم تطبيقها في إشارة AC عبر المقاوم 1 MΩ لإنشاء مصدر تيار مستمر. يمكن إضافة مؤثرات مباشرة إلى مستنبت في أي نقطة في الوقت المناسب. ب) تدابير ECIS مجموع كل المساهمات الفردية للمقاومة. المقاومة من مستنبت (R ميد)، وكذلك مقاومة الناجمة عن واجهة القطب / المنحل بالكهرباء، والذي هو البساطة كما عرضت مجموعة موازية من المقاوم (R إلكترونيات) ومكثف (C إلكترونيات)، وكذلك الخصائص الكهربائية من غشاء الخلية، التي وصفها اتصال موازية المقاومة (R الخليوي) والسعة (C م)، وكلها تحتاج إلى النظر فيها. R الخلية هو متغير، لأنه يعتمد على نفاذية الخلية نحو الحالي. حلبة يعادل يمكن تمديدها والمكرر بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. كمثال صلي (R Junc) كماوأضيفت أيضا تحت البطانة كمقاومة (R الفرعية) إلى الحلبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ومعنى مقاومة المعلمات البيولوجية
المعلمتين الأكثر مباشرة المستمدة من قياسات مقاومة هي المقاومة والسعة من الخلايا. المقاومة تمثل الجودة وظيفة من الجدار الخلوي وبالتالي يأخذ في الاعتبار المقاومة نحو شبه وتدفق التيار عبر الخلوي. يوفر السعة تدبير التغطية الشاملة القطب. ميزة مميزة من ECIS هو أنه مع مساعدة من الدوائر المكافئة ونمذجة تلك المعايير العالمية تقديم رؤى على العديد من الخصائص أكثر الخلوية، بما في ذلك خلية خلية وخلية الركيزة التصاقات، والتي سيتم مناقشتها لاحقا في هذه المقالة.
قبل البدء: conside التجريبيةحصص
الإعداد القياس – يتكون من عدة عناصر الإعداد منفصلة: جهاز ECIS مع الالكترونيات القياس؛ PC للحصول على البيانات؛ حامل مجموعة ل8 – 96 أو نظام جيدا؛ صفائف ECIS وثقافة خلية من خيار. يجب وضع حامل مجموعة في حاضنة وتوصيلها إلى الجهاز ECIS خارج الحاضنة. الكمبيوتر يحتاج إلى أن تكون مجهزة مع برنامج ECIS (1.2.123.0 14 فبراير 2013) وتوصيلها إلى الجهاز ECIS.
اختيار مجموعة – وهناك مجموعة متنوعة تزايد مستمر صفائف ECIS، والمصممة لتطبيقات متعددة. المصفوفات القياسية هي 8W1E وصفائف 8W10E، والتي تتكون من 8 آبار الثقافة (المشار إليها بواسطة W) تضم 1 أو 10 أقطاب القياس (المشار إليها بواسطة E)، على التوالي. A القطب المضاد كبيرة اكتمال الدائرة، ولكن مقاومة لها لا يكاد يذكر أساسا في القياس الفعلي 6. يمكن لل8 جيدا القياسية حامل مجموعة استضافة اثنين فيrrays، مما أدى إلى عدد 16 بئرا الثقافة. الأقطاب الذهب هي 50 نانومتر سميكة، ويرسم مع فيلم العازلة والتي شنت على إما واضحة بصريا يكسان الركيزة البولي أو لوحة الدوائر المطبوعة (PCB). صفائف PCB هي أكثر قوة وفعالية من حيث التكلفة. الشرائح شفافة تسمح للضوء والمناعي المجهري. ما يجب النظر هو أن مجموعة 1E يعزز التقلبات في إشارة المقاومة التي تسببها الاقتراحات خلية وهناك حاجة لدراسات التئام الجروح. بالإضافة إلى ذلك، واحد أقطاب تسمح ارتباط الإشارات الكهربائية والبصرية. في القطب صفائف متعددة، وبلغ متوسط إشارة على مدى عدة أقطاب، الذي يشمل نظرا لزيادة منطقة القياس المزيد من الخلايا في القياس، ويحد من التحيز البيانات بواسطة التلقيح متفاوتة ونمو الخلايا ويقلل من وضوح للإشارة إلى الخلية بسبب الاقتراحات. وبالتالي، فإن القطب صفائف متعددة هي مفيدة لدراسة تكاثر الخلايا وتشكيل حاجز. قربالمصفوفات القياسية وهناك المصفوفات الخاصة المتاحة لتطبيق إجهاد القص 9، لدراسة الكيميائي 10، الهجرة الخلية، وانتشار وكذلك لوحات 96 جيدا للعروض إنتاجية عالية. على أن تبرم، مجموعة ليتم استخدامها وتعتمد بشدة على مسألة علمية ونوع من الخلايا وينبغي اختيار بعناية واختبارها.
تردد القياس – النمذجة من الروبيديوم وألفا (انظر تحليل البيانات) يتطلب قياسات متعددة التردد (MFT). خلاف ذلك يمكن قياس مقاومة على مر الزمن في واحدة نوع من الخلايا تردد معين (SFT)، مع ميزة أنه يمكن جمع البيانات مع القرار الزماني أعلى. تردد القياس الأكثر حساسية لنوع خلية معينة يمكن العثور عليها عن طريق المسح الضوئي التردد. عندما بالتآمر على التوالي مقاومة المقاومة مقابل تردد في رسم بياني وتيرة تسجيل السجل حيث الفرق بين خالية من الخلايا والقطب المغطاة خلية هي أكبر هو التردد حيث منع خلايا تيانه الحالية أكثر فعالية. في حالة الخلايا البطانية (EC) هذا التردد هو في حوالي 4 كيلو هرتز.
كثافة البذر – كما هو الحال في كل خلية مقرها كثافة البذر التجربة العادية يعتمد على المشكلة العلمية. عند دراسة التصاق ونشر أو تشكيل حاجز، ينبغي المصنفة الخلايا البطانية مع كثافة عالية من 40،000-60،000 خلية / سم 2 لضمان متموجة، حاجز مستقرة بعد 48 ساعة. إذا كان التركيز التجربة على الانتشار، ينبغي المصنفة الخلايا البطانية ذات الكثافة المنخفضة من حوالي 2،000-10،000 خلية / سم 2.
ECIS هو أداة ممتازة لفحص خصائص الخلية والسلوك وكذلك لتقدير آثار المواد المعروفة وغير المعروفة. وبالتالي تقام الخلايا تحت الظروف القياسية الثقافة، مقاومة يمكن أن تراقب باستمرار مع القرار الزماني عالية وربطها الإشارات الضوئية. بهذه الطريقة نقطة الوقت الأمثل للتلاعب خلية يمكن اختيار على أساس الوضع الخلية المورفولوجية والوظيفية. للأسف، هذا القرار يأتي مع قياس عالية الثمن الذي تغييرات طفيفة في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة أو التحفيز الميكانيكي للخلايا (تغيير المتوسطة) سوف تؤثر على إشارة مقاومة الفور.
تطبيق القياس الحالي صغيرة لخلايا يجعل قياس ECIS موسع، غير تدميري، وخالية من التسمية، ولكن نتيجة لذلك فقط خصائص bioelectrical السلبي يمكن قياسها (أي إمكانات العمل). ومن السمات الرئيسية هي أن عددا من المعلمات يمكن أن يكون دير IVED من قياس واحد، والجمع بين المعلومات من عدة فحوصات الكلاسيكية، مثل النفاذية أو المقايسات التئام الجروح. هنا جانب معين للاهتمام هو أن البيانات غرار رياضيا يمكن استخدامها لاستكشاف التغيرات في المقاومة والسعة وإحالتهم إلى الهياكل الخلوية متميزة (مثل خلايا الأسماء أو غشاء الخلية). المهم هو أن نلاحظ أن مقاومة الطيفي يوفر دائما إشارة متوسط من جميع الخلايا على القطب الاستشعار عن بعد، والتي لا تسمح للدراسات على الخلايا واحد وأيضا نموذج رياضي صالحة فقط في طبقات الخلايا متموجة. ولذا ينبغي أن تعقد الخلايا البطانية في ولاية متكدسة ليوم واحد على الأقل قبل استخدامها للنمذجة لضمان ناضجة الخلايا وخلايا التصاقات هادئة. وبالمثل، ينبغي أن تطبق الجروح الكهربائية فقط إلى طبقات متموجة الخلية متعددة باستخدام نبضات جرح قصيرة مع الترددات العالية، لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة وجرح منع الضرر من الأقطاب الكهربائية.
jove_content "> للحصول على كمية ممكنة من المعلومات من قياس ECIS، كما هو الحال في كل فحص، العديد من المعلمات مثل الجمع بين مجموعة الركيزة، والطلاء وكثافة البذر لنوع من الخلايا الفردية تحتاج إلى اختبارها والأمثل أمام التجربة.وجود قيود كبيرة من ECIS هو أن القياس لا تقدم معلومات مباشرة على المستوى الجزيئي. وبالتالي قياسات ECIS وعادة ما تكون أكبر قدر من المعلومات في بداية سلسلة التجريبية للمساعدة في ربط مشكلة علمية مع الهياكل الخلوية أو خصائص وتوفير مدخلات هامة لتوليد فرضية قابلة للاختبار. وبالتالي فإن تصميم وحدات من ECIS يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات مع إمكانية مصممة خصيصا المصفوفات. تشير آخر التطورات مجموعة التركيز في المستقبل على إنتاجية عالية مقاومة للعروض تكاثر الخلايا وجرح الكهربائية وتقدم صفائف تدفق خاصة لمحاكاة في الجسم الحي </eم> إجهاد القص مع التشكيلات تدفق مختلفة.
مزيد من الأدب
يرجى الرجوع أيضا إلى صفحة ويب الفيزياء الحيوية التطبيقية (www.biophysics.com) لتطبيق مذكرات، ندوات وقائمة مفصلة من المطبوعات التي تغطي الطيف ECIS بأكمله.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشارلز Keese، الدكتور كريستيان Renken، كريستيان Dehnert (التطبيقية الفيزياء الحيوية وشركة)، والدكتور أولف Radler (ibidi شركة محدودة) لنصائحهم، ومساعدة ومناقشات مثمرة خلال إعداد هذه المخطوطة. مزيد نود أن نشكر يان فان بيزو لدعمه فنية ممتازة.