Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em> Drosophila</em> Antenn
Summary
Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.
Abstract
Doftämnen binder till sina mål-receptorer i en exakt och samordnat sätt. Varje receptor känner igen en specifik signal och vidarebefordrar denna information till hjärnan. Som sådan, att bestämma hur lukt information överförs till hjärnan, modifiera både perception och beteende, meriter utredning. Intressant nog finns det nya bevis för att cellöverföring och transkriptionsfaktorer är inblandade i diversifieringen av luktreceptor neuron. Här ger vi en robust hela montera immunologisk märkningsmetod för analys in vivo luktreceptor neuron organisation. Med denna metod, identifierade vi alla luktreceptor nervceller med anti-elav antikropp, en känd pan-neurala markören och Or49a-mCD8 :: GFP, en luktreceptor neuron specifikt uttryckt i NBA neuron med hjälp av anti-GFP antikropp.
Introduction
Luktsinnet används för att skilja mellan en enorm variation av luktmolekyler och därefter skicka den resulte information till högre hjärncentra. Denna ingång används för att exakt kontrollera grundläggande djurbeteenden, till exempel utfodring och parning 1-6. Eftersom varje lukt neuron typ är associerad med en specifik uppsättning av lukter, diversifiering av luktreceptor neuroner (ORN) s är nödvändig för korrekt luktsinne fungerar 7.
Drosophila genetik gör att vi kan utföra en enda cell nivå utredning som omfattar molekylära mekanismer i samband med Örn utveckling och fysiologisk funktion 8-16. Hela berget immunfärgning av Drosophila antenner har gjort det möjligt för oss att förstå mer i detalj de molekylära mekanismer som är inblandade i diversifieringen av luktreceptor neuroner (ORN) s 7. Häri vi ge en heltäckande beskrivning av en enkel metod för att achieve detta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den dissekering av Drosophila antenn vi beskriver är enkel och lätt att utföra i en laboratoriemiljö. För att säkerställa en lyckad dissektion är det väsentligt att utnyttja fina kanter sax. Medan immunofärgning dissekerade antenn, är det viktigt att inkubera dem i en fuktfylld behållare för att undvika avdunstning av antikroppslösningen. Den dissekerade antenn har en tendens att flyta i lösningen. Användning av 0,1% Triton i PBS under fixering och blockering steg underlättar nedsänkning av an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av MEXT-stödda programmet för Stiftelsen för Strategisk Forskning vid privata universitet och JSPS Young Scientist B bidrag för HT Vi vill tacka Ohtake Norihito att redigera videoklipp.
Materials
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. . Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
