Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Los virus de ARN son responsables de una gran variedad de infecciones humanas, y tienen un gran impacto en las poblaciones de todo el mundo, tanto en términos de salud pública y el coste económico. Vacunas eficaces se han desarrollado contra varios virus de ARN humano, y son ampliamente utilizados como tratamientos profilácticos. Sin embargo, todavía hay una falta crítica de fármacos terapéuticos contra las infecciones de virus de ARN. De hecho, las vacunas eficaces no están disponibles frente a las principales patógenos humanos, tales como el virus del dengue, virus de la hepatitis C o el virus sincitial respiratorio humano (VRSh). Además, los virus de ARN son responsables de la mayoría de las enfermedades emergentes, que han aumentado en frecuencia a causa de los intercambios mundiales y el impacto humano sobre los sistemas ecológicos. Contra esta amenaza que representan los virus ARN, nuestro arsenal terapéutico es muy limitado y relativamente ineficiente ^1-3. Las terapias actuales se basan esencialmente en el tipo recombinante I interferones (IFN-α / β) para estimular la inmunidad innata,o la administración de ribavirina. Aunque el modo de acción de este análogo de ribonucleósido es controvertido y probablemente se basa en diversos mecanismos, la inhibición de la IMPDH celular (inosina monofosfato deshidrogenasa), que agota piscinas GTP intracelulares, es claramente esencial ^4. La ribavirina, en combinación con pegilado IFN-α, es el principal tratamiento contra el virus de la hepatitis C. Sin embargo, los tratamientos de IFN-α / β y ribavirina son de relativamente poca eficacia in vivo contra la mayoría de los virus de ARN, ya que de manera eficiente contundente IFN-α / β señalización a través de la expresión de factores de virulencia ⁵ y, a menudo escapar ribavirina ^3. Esto sumado al hecho de que el tratamiento con ribavirina está planteando problemas de toxicidad importantes, a pesar de que recientemente se aprobó contra la enfermedad VRSh grave con beneficios controversiales ^6. Más recientemente, algunos tratamientos específicos para el virus se han comercializado, en particular, contra el virus de la gripe con el o desarrolloinhibidores de la neuraminidasa f ^3. Sin embargo, la gran diversidad y la aparición permanente de los virus de ARN se opone al desarrollo de tratamientos específicos contra cada uno de ellos en un futuro relativamente cercano. En conjunto, esto subraya la necesidad de estrategias eficaces para identificar y desarrollar moléculas antivirales potentes en un futuro próximo.

Es trivial decir que un inhibidor de amplio espectro activo frente a un gran panel de virus de ARN podría resolver este problema. Aunque tal molécula sigue siendo el sueño de un virólogo, nuestro conocimiento de los mecanismos de defensa celular y el sistema inmune innato sugieren que existen algunas posibilidades ^7,8. Varios laboratorios académicos e industriales están buscando moléculas que estimulan facetas específicas de los mecanismos de defensa celular o rutas metabólicas para embotar la replicación viral. Aunque tales compuestos probablemente mostrar efectos secundarios significativos, tratamientos contra las infecciones virales agudas serán administrarcado desde hace relativamente poco tiempo, lograr que sean aceptables a pesar de cierta toxicidad potencial en el largo plazo. Varias estrategias se han desarrollado para identificar tales moléculas antivirales de amplio espectro. Algunos programas de investigación tienen por objeto la búsqueda de moléculas que se dirigen a las vías de defensa o metabólicas específicas. Esto incluye, por ejemplo, receptores de reconocimiento de patógeno para provocar la expresión de genes antivirales ⁹ y activar factores antivirales tales como RNaseL ^10, maquinaria autofagia para promover la degradación de virus de ^11, la síntesis de nucleósido vías ^12,13, o cascadas apoptóticas para precipitar la muerte de las células infectadas por virus ^14. Otros grupos han desarrollado pantallas fenotípicas que no son objetivo basadas en ^13,15-17. En ese caso, las moléculas antivirales son simplemente identifican por su capacidad para bloquear la replicación viral en un sistema celular dado. La suposición general es que un compuesto inhibidor 2-3 virus ARN sin relación tendría un perfil adecuado para una amplia-spectrum molécula antiviral. El modo de acción de los compuestos seleccionados de golpe con un enfoque empírico sólo se determina en un segundo tiempo y, finalmente, puede conducir a la identificación de dianas celulares nuevos de antivirales. Curiosamente, un análisis retrospectivo de los nuevos medicamentos aprobados por la Food and Drug Administration de EE.UU. entre 1999 y 2008 ha puesto de manifiesto que, en general, dichas proyecciones fenotípicas tienden a obtener mejores resultados que los enfoques basados ​​en metas de descubrir drogas ¹⁸ de molécula pequeña primero en su clase .

La replicación viral en ensayos basados ​​en células de alto rendimiento se determinará a partir de los efectos citopáticos del virus. Las células se infectan y se cultivaron en 96 – o placas de 384 pocillos en presencia de compuestos ensayados. Después de pocos días, las capas celulares se fijaron y se tiñeron con colorantes tales como violeta cristal. Por último, se determina la absorbancia con un lector de placas y los compuestos que inhiben la replicación viral se identifican por su capacidad para conservar capas celulares lado a otrom de virus inducida por efecto citopático. Por otra parte, los efectos citopáticos mediadas por virus que se determina utilizando ensayos estándar de viabilidad como la reducción de MTS. Tales ensayos son altamente manejable y rentable, pero sufren de tres importantes limitaciones. En primer lugar, requieren una combinación virus-célula, donde la replicación viral es citopático en sólo unos pocos días, pero esto no siempre es posible, por lo que exigen enfoques alternativos ^19. En segundo lugar, son poco cuantitativa, ya que se basan en una medida indirecta de la replicación viral. Finalmente, los compuestos tóxicos pueden ser calificados como positivos hits, y por lo tanto deben ser eliminados con una pantalla de contador que mide la viabilidad celular. Para superar algunos de estos obstáculos, virus o replicones recombinantes han sido diseñados por la genética inversa para expresar proteínas informadoras, tales como EGFP o luciferasa, desde una unidad de transcripción adicional o en el marco con genes de proteínas virales (algunos ejemplos son ^20-23). Cuando estos virus se replican, pr reporterooteins se producen junto con las propias proteínas virales. Esto proporciona un ensayo muy cuantitativo para medir la replicación viral y evaluar la actividad inhibidora de las moléculas candidatas. Esto es particularmente cierto para los virus recombinantes que expresan luciferasa (u otras enzimas capaces de bioluminiscencia) ya que este sistema reportero exhibe un amplio rango dinámico con una alta sensibilidad y prácticamente sin fondo. Además, no hay una fuente de luz de excitación, evitando así la interferencia con fluorescencia compuesto ^24.

Aquí, nos detalle un protocolo de alto rendimiento para examinar bibliotecas químicas para los inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Los compuestos se ensayan primero en células humanas infectadas con un virus recombinante sarampión (MV) que expresa luciferasa de luciérnaga ²⁵ (rMV2/Luc, la Figura 1, la pantalla principal). MV pertenece a MONONEGAVIRALES orden, y es a menudo considerado como un miembro prototípico de virus de ARN de cadena negativaes. Como tal, MV genoma se utiliza como una plantilla por la polimerasa viral para sintetizar moléculas de ARNm que codifican para las proteínas virales. En la cepa recombinante MV llamado rMV2/Luc, la expresión de luciferasa se ​​expresa a partir de una unidad de transcripción adicional insertado entre los genes P y M (Figura 2A). En paralelo, los compuestos se ensayaron para determinar su toxicidad en células humanas utilizando un reactivo basado en luciferasa comercial que evalúa, mediante la cuantificación de ATP, el número de células metabólicamente activas en el cultivo (Figura 1, la pantalla principal). Bibliotecas químicas enteras pueden ser fácilmente evaluados con estos dos ensayos con el fin de seleccionar compuestos que no son tóxicos y bloquean eficazmente la replicación del MV. Luego, los golpes se volvieron a ensayar para la inhibición dosis-respuesta de la replicación del MV, la falta de toxicidad, así como por su capacidad de alterar el virus Chikungunya (CHIKV) replicación (Figura 1, la pantalla secundaria). CHIKV es un miembro de la familia Togaviridae y su genoma es apositive molécula de una sola cadena de ARN. Como tal, es completamente no relacionado con el sarampión y compuestos que inhiben tanto MV y CHIKV destacan una gran oportunidad para inhibir un gran panel de los virus ARN. Proteínas no estructurales CHIKV se traducen directamente desde el genoma viral, mientras que las proteínas estructurales son codificadas por la transcripción y traducción de una molécula de ARNm subgenómico. Nuestro ensayo de replicación in vitro para CHIKV se basa en una cepa recombinante llamado CHIKV / Ren, que expresa enzima luciferasa de Renilla como una parte escindida de la poliproteína no estructural a través de una inserción del gen reportero entre nsP3 y nsP4 secuencias ²⁶ (Figura 2B). La medida de la actividad de luciferasa de Renilla permite la monitorización de la replicación viral en la primera etapa del ciclo de vida CHIKV.

Este protocolo de alto rendimiento se utiliza para identificar de forma rápida los compuestos con un perfil adecuado de antivirales de amplio espectro en una biblioteca comercial de 10.000 molecdulos enriquecida por la diversidad química. Los compuestos fueron esencialmente siguiendo la regla del cinco de Lipinski, con pesos moleculares que van desde 250 hasta 600 daltons, y registrar valores de D por debajo de 5. La mayoría de estas moléculas eran nuevas entidades químicas que no están disponibles en otras bibliotecas comerciales.