Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die für die Mehrheit der neu auftretenden Krankheiten, die in der Frequenz wegen der globalen Austausch und menschlichen Auswirkungen auf ökologische Systeme erhöht haben verantwortlich. Gegen diese Bedrohung, die RNA-Viren darstellen, ist unser therapeutisches Arsenal äußerst begrenzt und relativ ineffizient ^1-3. Gegenwärtige Therapien beruhen im wesentlichen auf rekombinanten Typ I-Interferone (IFN-α / β), um angeborene Immunität stimulieren basiert,oder die Verabreichung von Ribavirin. Obwohl die Wirkungsweise dieser Ribonukleosid analogen umstritten ist und wahrscheinlich von mehreren Mechanismen, der Hemmung der zellulären IMPDH (Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase), die die intrazelluläre GTP-Pools erschöpft ist eindeutig erforderlich ^4. Ribavirin in Kombination mit pegyliertem IFN-α, ist die Haupt Behandlung gegen Hepatitis C-Virus. Allerdings sind die relativ geringe Wirksamkeit in vivo gegen die meisten RNA-Viren IFN-α / β und Ribavirin Behandlungen, wie sie effizient stumpfen IFN-α / β Signaltransduktion durch Expression von Virulenzfaktoren ⁵ und oft entkommen Ribavirin ^3. Dieser Mehr der Tatsache, dass Ribavirin Behandlung wichtiger Fragen Toxizität erhöhen, obwohl es vor kurzem gegen schwere Krankheit mit HRSV umstrittene Vorteile ⁶ genehmigt ^wurde. In jüngerer Zeit sind einige virusspezifischen Behandlungen wurden vermarktet, insbesondere gegen Influenzavirus mit der Entwicklung of Neuraminidase-Hemmer ^3. Die große Vielfalt und dauerhafte Auftreten von RNA-Viren verhindert jedoch die Entwicklung von spezifischen Behandlungen gegen jeden von ihnen in relativ naher Zukunft. Insgesamt unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine effiziente Strategien, um in der nahen Zukunft zu identifizieren und zu entwickeln, starke antivirale Moleküle.

Es ist trivial zu sagen, dass ein Breitspektrum-Inhibitor aktiv gegen eine große Gruppe von RNA-Viren würde dieses Problem lösen. Obwohl ein solches Molekül ist immer noch ein Virologe Traum, unser besseres Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen und angeborene Immunsystem nahe, dass einige Möglichkeiten gibt es ^7,8. Mehrere akademischen und industriellen Laboratorien versuchen nun, Moleküle, die bestimmte Aspekte der zellulären Abwehrmechanismen oder Stoffwechselwege, die virale Replikation stumpf zu stimulieren. Obwohl solche Verbindungen wahrscheinlich zeigen erhebliche Nebenwirkungen, werden Behandlungen gegen akute Virusinfektionen zu verabreichened für eine relativ kurze Zeit, so dass sie trotz einer möglichen Toxizität auf lange Sicht akzeptabel. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um solche Breitspektrum-antiviralen Moleküle zu identifizieren. Einige Forschungsprogramme zielen auf die Suche nach Molekülen, die spezifische Abwehr oder Stoffwechselwege abzielen. Dazu gehören zum Beispiel Krankheitserreger Erkennungsrezeptoren auf eine antivirale Genexpression ⁹ entlocken und aktivieren antiviralen Faktoren wie RNaseL ^10, Autophagie Maschinen Virus Abbau ¹¹ zu fördern, Nucleosidsynthese Pfade ^12,13, oder apoptotischen Kaskaden zum Tod von Virus-infizierten Zellen ausfallen ^14. Andere Gruppen haben phänotypische Bildschirme, die nicht ziel basieren ^13,15-17 entwickelt. In diesem Fall werden die antivirale Moleküle einfach durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, um die virale Replikation in einem gegebenen zellularen Systems blockieren. Die allgemeine Annahme ist, dass eine Verbindung Hemmung 2-3 unabhängigen RNA-Viren wäre ein geeignetes Profil für eine breit spectrum antiviralen Moleküls. Die Wirkungsweise der Trefferverbindungen mit einer solchen empirischen Ansatz gewählt wird erst in einem zweiten Zeitpunkt bestimmt und schließlich kann die Identifizierung von neuartigen zellulären Ziele für antivirale Medikamente führen. Interessant ist, dass eine retrospektive Analyse der von der US Food and Drug Administration zwischen 1999 und 2008 zugelassenen neuen Medikamenten hat gezeigt, dass im Allgemeinen, wie phänotypischen Screenings tendenziell besser als zielorientierte Ansätze durchführen, um first-in-class, niedermolekulare Medikamente ¹⁸ entdecken .

Virusreplikation in Hochdurchsatz-Assays auf Zellbasis wird in der Regel von Virus zytopathische Effekte bestimmt. Zellen infiziert und in 96 – oder 384-Well-Platten in Gegenwart der getesteten Verbindungen. Nach einigen Tagen werden die Zellschichten fixiert und mit Farbstoffen, wie Kristallviolett gefärbt. Schließlich wird die Absorption mit einem Plattenlesegerät und Verbindungen Hemmung der viralen Replikation durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Zellschichten her erhalten bestimmtm-Virus-induzierten zytopathischen Effekt. Alternativ werden viral-vermittelte zytopathischen Effekte mit Standard Lebensfähigkeit Assays wie MTS Reduktion beurteilt. Solche Assays sind hoch handhabbar und kostengünstig, aber leiden unter drei Hauptbeschränkungen. Erstens erfordern sie eine Virus-Zell-Kombination, bei der die virale Replikation ist zytopathischen in nur wenigen Tagen, aber dies ist nicht immer möglich, so fordern alternative Ansätze ^19. Zweitens sind sie schlecht quantitative da sie auf einer indirekten Messung der Virusreplikation basiert. Schließlich können toxische Verbindungen wie positive Treffer erzielt werden und müssen daher mit einer Gegen Bildschirm messen Zelllebensfähigkeit beseitigt werden. Um einige dieser Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Viren oder Replikons durch reverse Genetik entwickelt worden, Reporterproteine, wie EGFP oder Luciferase exprimieren, aus einer weiteren Transkriptionseinheit oder in Rahmen mit Virusprotein-Gene (einige Beispiele ^20-23). Wenn diese Viren replizieren, Reporter proteins zusammen mit viralen Proteine ​​selbst hergestellt. Dies stellt eine sehr quantitative Assay die virale Replikation Messung und Bewertung der inhibitorischen Aktivität des Kandidaten-Moleküle. Dies gilt insbesondere für rekombinante Viren, die Luciferase (oder andere Enzyme, die Biolumineszenz), da dies Reportersystem weist einen weiten Dynamikbereich mit einer hohen Empfindlichkeit und praktisch ohne Hintergrund. Darüber hinaus gibt es keine Anregungslichtquelle, wodurch Interferenzen mit ²⁴ Fluoreszenzverbindung.

Hier haben wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Protokoll auf chemische Bibliotheken für Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren zu untersuchen. Die Verbindungen werden zuerst auf menschliche Zellen mit einem rekombinanten Masernvirus (MV) zum Ausdruck Firefly Luziferase ²⁵ (rMV2/Luc, Bild 1, primären Bildschirm) infiziert getestet. MV gehört zu bestellen Mononegavirales und wird oft als eine prototypische Mitglied der Negativstrang RNA-Virus alsEs. Als solches ist MV-Genom als Matrize durch die virale Polymerase verwendet, um mRNA-Molekülen codiert für virale Proteine ​​zu synthetisieren. In dem rekombinanten MV-Stamm genannt rMV2/Luc wird die Luciferase-Expression von einer zusätzlichen Transkriptionseinheit zwischen P und M-Gene (Fig. 2A) einge ausgedrückt. Parallel Verbindungen für ihre Toxizität auf menschlichen Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Luciferase-Reagens, das, zur Quantifizierung von ATP getestet, die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur (Fig. 1, primären Bildschirm). Gesamte chemischen Bibliotheken lassen sich mit diesen beiden Tests, um Verbindungen, die nicht giftig sind und MV-Replikation effizient zu blockieren wählen abgeschirmt werden. Dann werden Treffer für Dosis-Wirkungs-Hemmung der MV-Replikation, das Fehlen von Toxizität als auch für ihre Fähigkeit, Chikungunya-Virus (CHIKV) Replikation (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) beeinträchtigen erneut getestet. CHIKV ist ein Mitglied der Familie und Togaviridae sein Genom ist apositive Einzelstrang-RNA-Molekül. Als solches ist es völlig unabhängig von Masern und Verbindungen Hemmung sowohl MV und CHIKV stehen eine große Chance, eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. CHIKV Nicht-Strukturproteine ​​werden von dem viralen Genom übersetzt, während Strukturproteine ​​werden durch Transkription und Translation einer subgenomischen mRNA-Molekül kodiert. Unsere in vitro-Assay für die Replikation CHIKV auf einem rekombinanten Stamm genannt CHIKV / Ren, die Renilla-Luciferase-Enzym als gespaltenen Teil der Nicht-Struktur Polyprotein durch eine Einsetzöffnung des Reportergens zwischen nsP3 und nsP4 Sequenzen ²⁶ (Fig. 2B) auf der Basis drückt. Das Maß der Renilla-Luciferase-Aktivität erlaubt die Überwachung der viralen Replikation in einem frühen Stadium des Lebenszyklus CHIKV.

Das Hochdurchsatz-Protokoll wurde verwendet, um schnell Verbindungen zu identifizieren mit einem geeigneten Profil für Breitspektrum antiviralen Medikamenten in einer kommerziellen Bibliothek von 10.000 MoleModule für die chemische Vielfalt bereichert. Die Verbindungen wurden im Wesentlichen folgende Lipinski-Regel von fünf, mit Molekulargewichten im Bereich von 250 bis 600 Dalton und log D-Werten unter 5. Die meisten dieser Moleküle wurden neue chemische Wirkstoffe in anderen kommerziellen Bibliotheken nicht verfügbar sind.