الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإصابات البشرية، ويكون لها تأثير كبير على السكان في جميع أنحاء العالم سواء من حيث الصحة العامة والتكلفة الاقتصادية. وقد تم تطوير لقاحات فعالة ضد العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الإنسان، وتستخدم على نطاق واسع كعلاج وقائي. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص حاد في الأدوية العلاجية ضد عدوى فيروس الحمض النووي الريبي. في الواقع، لقاحات فعالة ليست متاحة ضد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية، مثل فيروس حمى الضنك وفيروس التهاب الكبد C أو الجهاز التنفسي المخلوي الفيروس الإنسان (hRSV). الى جانب ذلك، فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن غالبية الأمراض المستجدة، والتي تزايدت وتيرتها بسبب البورصات العالمية وتأثير الإنسان على النظم الايكولوجية. ضد هذا التهديد التي تمثل فيروسات الحمض النووي الريبي، ترسانة العلاجية لدينا محدودة للغاية وغير فعالة نسبيا ^1-3. وتقوم العلاجات الحالية أساسا على نوع المؤتلف أنا إنترفيرون (الإنترفيرون α / β) لتحفيز المناعة الفطرية،أو إدارة ريبافيرين. على الرغم من أن طريقة عمل هذا ريبونوكليوزيد التناظرية مثيرة للجدل ويعتمد على آليات مختلفة ربما، وتثبيط IMPDH الخلوية (إينوزين أحادي هيدروجين)، والذي يستنزف حمامات GTP داخل الخلايا، أمر ضروري بشكل واضح ^4. ريبافيرين، بالاشتراك مع مضاد للفيروسات الإنترفيرون α، هو العلاج الرئيسي ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C. ومع ذلك، والعلاج الإنترفيرون α / β وريبافيرين هي فعالية فقيرة نسبيا في الجسم الحي ضد معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي لأنها حادة كفاءة الإنترفيرون α / β يشير من خلال التعبير عن عوامل الفوعة ⁵ وغالبا ما يفلتون من ريبافيرين ^3. وأضاف هذا إلى حقيقة أن العلاج ريبافيرين يثير قضايا هامة السمية، على الرغم من أنه تمت الموافقة مؤخرا ضد مرض hRSV شديدة مع فوائد مثيرة للجدل ^6. في الآونة الأخيرة، وقد تم تسويق بعض العلاجات الفيروس محددة، ولا سيما ضد فيروس الانفلونزا مع س التنميةو مثبطات النورامينيداز ^3. ومع ذلك، فإن التنوع الكبير وظهور دائم للفيروسات الحمض النووي الريبي يحول دون تطوير علاجات محددة ضد كل واحد منهم في مستقبل قريب نسبيا. تماما، وهذا يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات فعالة لتحديد وتطوير جزيئات مضادة للفيروسات قويا في المستقبل القريب.

فمن تافهة القول بأن المانع واسع الطيف فعال ضد فريق كبير من فيروسات الحمض النووي الريبي من شأنه أن يحل هذه المشكلة. على الرغم من أن مثل هذا الجزيء لا يزال حلم عالم الفيروسات، وفهم أفضل لدينا من آليات الدفاع الخلوية ونظام المناعة الفطرية تشير إلى أن بعض الاحتمالات موجودة ^7،8. العديد من المختبرات الأكاديمية والصناعية يسعون الآن الجزيئات التي تحفز جوانب محددة من آليات الدفاع الخلوية أو المسارات الأيضية لفظة تكاثر الفيروس. على الرغم من أن هذه المركبات ربما تظهر آثار جانبية كبيرة، وعلاجات ضد الالتهابات الفيروسية الحادة تكون الادارىإد لفترة قصيرة نسبيا، مما يجعلها مقبولة على الرغم من بعض السمية المحتملة على المدى الطويل. وقد وضعت استراتيجيات مختلفة لتحديد مثل هذه واسعة الطيف الجزيئات المضادة للفيروسات. تهدف بعض البرامج البحثية في إيجاد الجزيئات التي تستهدف الدفاع أو التمثيل الغذائي مسارات محددة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، المستقبلات الاعتراف الممرض للحصول المضادة للفيروسات التعبير الجيني ⁹ وتفعيل العوامل المضادة للفيروسات مثل RNaseL ^10، والآلات الالتهام الذاتي لتعزيز تدهور الفيروس ^11، والتوليف نوكليوزيد مسارات ^12،13، أو شلالات أفكارك لترسيب موت الخلايا المصابة بالفيروسات ^14. وقد وضعت مجموعات أخرى شاشات المظهرية التي لا تستهدف المستندة ^13،15-17. في هذه الحالة، يتم تحديد الجزيئات المضادة للفيروسات ببساطة عن طريق قدرتها على منع تكاثر الفيروس في نظام الهاتف الخلوي معين. الافتراض العام هو أن مركب تثبيط 2-3 فيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها سيكون له الشخصى مناسبة ل-SP واسعةectrum جزيء مضاد للفيروسات. يتم تحديد طريقة عمل مركبات ضرب المحدد مع هذا النهج التجريبية فقط في المرة الثانية، وفي نهاية المطاف، قد يؤدي إلى تحديد أهداف الخلوية رواية لمضادات الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت تحليل بأثر رجعي من الأدوية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بين عامي 1999 و 2008 أنه في عام، مثل هذه الفحوصات المظهرية تميل إلى أداء أفضل من النهج القائم على الهدف لاكتشاف أول في فئة المخدرات جزيء صغير ¹⁸ .

عادة ما يتم تحديده تكاثر الفيروس في المقايسات خلية مقرها الإنتاجية العالية من الفيروس آثار الاعتلال الخلوي. والخلايا المصابة والمثقف في 96 – أو لوحات 384 جيدا في وجود مركبات اخضعت للاختبار. بعد بضعة أيام، يتم إصلاح الطبقات الخلوية وملطخة الأصباغ مثل الكريستال البنفسجي. أخيرا، يتم تحديد الامتصاصية مع تحديد قارئ لوحة ومركبات تثبيط تكاثر الفيروس عن طريق قدرتها على الحفاظ على الطبقات الخلوية جيئة وذهاباتأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس م. بدلا من ذلك، يتم تقييم آثار الاعتلال الخلوي بوساطة فيروسي باستخدام فحوصات سلامة قياسية مثل تخفيض MTS. هذه القياسات ليست لين العريكة للغاية وفعالة من حيث التكلفة، ولكن تعاني من القيود الرئيسية الثلاثة. الأولى، فإنها تتطلب مجموعة خلايا الفيروس حيث تكاثر الفيروس هو الاعتلال الخلوي في أيام قليلة فقط ولكن هذا ليس ممكنا دائما، وبالتالي الدعوة إلى النهج البديلة ^19. الثانية، فهي الكمي سيئة لأنها تستند إلى مقياس غير مباشر من تكاثر الفيروس. أخيرا، ومركبات سامة يمكن سجل الزيارات كما إيجابية، وبالتالي يجب القضاء مع شاشة العداد قياس الجدوى الخلوية. للتغلب على بعض هذه العقبات، قد تم تصميمها من الفيروسات أو المؤتلف replicons بواسطة الوراثة العكسية للتعبير عن البروتينات المراسل، مثل EGFP أو luciferase المراسل، من وحدة النسخ إضافية أو في الإطار مع جينات البروتين الفيروسي (أمثلة قليلة هي ^20-23). عند تكرار هذه الفيروسات، مراسل الأسبوعيةويتم إنتاج oteins جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية نفسها. وهذا يوفر مقايسة الكمية جدا لقياس تكاثر الفيروس وتقييم النشاط المثبطة الجزيئات مرشح. هذا صحيح بصفة خاصة للبحث عن الفيروسات المؤتلف معربا عن luciferase المراسل (أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي) لأن هذا النظام مراسل المعروضات مجموعة واسعة ديناميكية مع حساسية عالية ويكاد لا توجد خلفية هذا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد أي مصدر للضوء الإثارة، وبالتالي منع التداخل مع مضان مجمع ^24.

هنا، لدينا بروتوكول الإنتاجية العالية من التفصيل لفحص المكتبات الكيميائية لمثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم اختبار المركبات الأولى على الخلايا البشرية المصابة بفيروس الحصبة المؤتلف (MV) معربا عن يراعة luciferase المراسل ²⁵ (rMV2/Luc، الشكل 1، الشاشة الرئيسية). MV ينتمي إلى Mononegavirales النظام، وغالبا ما تعتبر عضوا تنميط فيروس RNA سلبي حبلاوفاق. على هذا النحو، يتم استخدام MV الجينوم كقالب من قبل البلمرة الفيروسية لتجميع جزيئات مرنا ترميز للبروتينات الفيروسية. في سلالة MV المؤتلف دعا rMV2/Luc، وأعرب عن التعبير luciferase المراسل من وحدة النسخ الإضافية تدرج بين P والجينات M (الشكل 2A). في موازاة ذلك، يتم اختبار المركبات السمية على الخلايا البشرية باستخدام كاشف القائم على luciferase المراسل التجارية التي يقيم، من خلال القياس الكمي ATP، وعدد من خلايا نشطة عملية الأيض في الثقافة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). المكتبات الكيميائية بالكامل يمكن فرزهم بسهولة مع هذه المقايسات اثنين من أجل تحديد المركبات التي ليست سامة ومنع بكفاءة MV النسخ المتماثل. ثم، يتم اختبارها إصابات لتثبيط الاستجابة للجرعة من MV النسخ المتماثل، وعدم وجود سمية فضلا عن قدرتها على إضعاف الفيروس شيكونغونيا (CHIKV) التكرار (الشكل 1، وشاشة ثانوية). CHIKV هو عضو في عائلة الفيروسات الطخائية والجينوم هو أبositive منفردة الجديلة جزيء الحمض النووي الريبي. على هذا النحو، فمن لا علاقة لها تماما لالحصبة ومركبات تثبيط كلا MV وCHIKV تقف فرصة كبيرة لمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم تحويل البروتينات ابنيوي CHIKV مباشرة من الجينوم الفيروسي، في حين يتم ترميز البروتينات الهيكلية التي كتبها النسخ والترجمة من جزيء الرنا subgenomic. ويستند لدينا في المختبر تكرار الفحص لCHIKV على سلالة المؤتلف دعا CHIKV / رن، الذي يعبر عن Renilla انزيم luciferase المراسل كجزء المشقوق من polyprotein ابنيوي من خلال إدخال الجين المراسل بين nsP3 وتسلسل nsP4 ²⁶ (الشكل 2B). مقياس Renilla luciferase النشاط يسمح للرصد تكاثر الفيروس في مرحلة مبكرة من دورة حياة CHIKV.

وقد استخدم هذا البروتوكول الإنتاجية العالية لتحديد المركبات بسرعة مع لمحة مناسبة لمضادات الفيروسات واسع الطيف في مكتبة تجارية من 10،000 molecالمخصب ules للتنوع الكيميائية. مركبات كانوا يتبعون أساسا حكم يبينسكي من خمسة، مع الأوزان الجزيئية تتراوح 250-600 دالتون، وتسجيل القيم D أقل من 5. وكان معظم هذه الجزيئات كيانات كيميائية جديدة غير متوفرة في المكتبات التجارية الأخرى.