La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados⁺ Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em> Ex vivo</em> Co-cultura del sistema.

Notas generales Es importante mantener las células en cultivo sin ningún antibiótico, ya que las infecciones bacterianas incluso controlada puede ser detectada por PBMCs. Tal detección de componentes bacterianos inducirá un fondo producción de interferón que no se puede distinguirse de la provocada por el VIH-1 específica de detección. Además, todas las células tienen que ser probados rutinariamente para la ausencia de contaminación por micoplasma. Siempre use soluciones de endotoxina libre siempre que sea posible. Flow caracterización de citometría de las diferentes células que se utilizará en los co-cultivos (PBMCs, PDC, MT4 y las células T CD4 +) es un paso opcional, pero muy recomendable, ya que puede proporcionar información valiosa necesaria para la correcta interpretación de un experimento dado. 1. Preparación de las células diana infectadas Mantener humano línea de células T CD4 + MT4 en RPMI 1640 mediun suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), que se refiere de ahora en adelante como medio RPMI-1640 completo. Aislamiento de células primarias T CD4 +. Aislar las células mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Aislar los linfocitos T CD4 + utilizando un kit de selección negativa células T CD4 +, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Activar los linfocitos T CD4 + con PHA-L (5 mg / ml) durante 48 horas y después mantener las células en medio RPMI-1640 completo suplementado con IL-2 recombinante (100 U / ml). Infectar las células T 5 días después de aislamiento primario. La infección de las células diana (línea celular MT4 T o células primarias heterólogos T CD4 +). Dos días antes de la co-cultivo, infectar las células T con virus VIH-1. En el ejemplo específico descrito aquí se utilizaron-GFP_ires_Nef pNL4.3 tipo salvaje (WT) o pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus. Estas cepas virales representan green proteína fluorescente (GFP) -marcado clones moleculares infecciosos isogénicas que difieren únicamente en su capacidad para expresar Vpu. Utilice diferentes multiplicidades de infección (MOI) y seleccione culturas con niveles similares de infección para los compañeros de las culturas. El día del co-cultivo, determinar el porcentaje de células GFP + por citometría de flujo como un marcador de la infección. Utilice sólo las culturas con un rango de 20 a 50% de células infectadas para co-cultivos. Pasos opcionales: Realizar tinción de citometría de flujo en este momento para evaluar la expresión superficial de moléculas / ligandos de interés como BST2, y CD4. Para la tinción de la superficie celular, resuspender 0,5 x 10 6 células T en 100 l de solución de lavado, añadir 1 l de anti-CD4_PerCP / Cy5.5 y 1 l de anti-BST2_A660. Incubar los tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado. Si los estudios están dirigidos a evaluar el papel de la mediada Vpu antagonismo BST2, realice una partícula de VIH-1ensayo de liberación en este momento como se ha descrito previamente 15. 2. El aislamiento y enriquecimiento de Sintiendo células (PBMCs enteros o enriquecidos PDC) Nota: Cuando se utilizan PBMC para la detección, se inicia el aislamiento dentro de media hora después de la extracción de sangre y llevar a cabo de una manera oportuna. Utilice PBMCs de inmediato para los compañeros de culturas o de enriquecimiento PDC. Aislar las células mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Paso opcional: Realizar la tinción de citometría de flujo multiparamétrica para confirmar que los PBMCs recién aisladas contienen los diferentes linajes de células en proporciones fisiológicas. Para la tinción de superficie celular, resuspender 10 6 PBMCs en 100 l de solución de bloqueo Fc, y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Después del bloqueo, añadir 1 l de anti-CD3_Pacific azul (para las células T), 1 l de anti-CD14-PE_Texas Rojo (por células mieloides), 4 l de anti-BDCA2_APC y 1 l de anti-ILT7_PE (por PDC). Incubartubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado. Enriquecer PDC utilizando un kit de selección negativa pDC, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se recomienda trabajar con rapidez, mantener las células en frío, y el uso de soluciones pre-enfriado. Esto evitará que la nivelación de anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado de células no específico, así como asegurar la actividad pDC máxima. Realizar multi-paramétrico de análisis de citometría de flujo de las PDC recién aisladas para confirmar la pureza, el porcentaje de enriquecimiento, y cantidades relativas de pDC- marcadores de superficie específica (tales como ILT7 y BDCA2). Para la tinción de superficie celular, resuspender 10 4 PDC en 100 l de solución de bloqueo Fc, y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Después del bloqueo, añadir 1 l de anti-CD3_Pacific Azul, 1 l de anti-CD14_PE_Texas Rojo, 4 l de anti-BDCA2_APC y 1 l de anti-ILT7_PE. Incubar los tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado (PBS, 5EDTA mM, 5% de FBS). Se recomienda un mínimo de 40% de pureza pDC (si el material de partida tiene 0,4% pDC, esto sería equivalente a un enriquecimiento de 100 veces). 3. Co-cultivo de células infectadas T CD4 + y células de detección (PBMCs enteros o enriquecidos PDC) Mezclar 220 l de PBMCs (diluido a 850.000 células / ml) o 220 l de PDC (a una concentración que varía de 100.000 a 500.000 células / ml) con 30 l de células T infectadas (diluido en 10 6 células / ml) por pocillo en una placa de fondo en U 96. Como solo los controles, PBMCs placa o PDC y células T. Ajustar el volumen en el pozo a 250 l con medio RPMI 1640 completo. Evaluar las respuestas celulares a conocido agonista de las vías TLR7 y TLR9. Con este fin, la placa 220 l de PBMCs (diluido a 850.000 células / ml) o 200 l de PDC (a una concentración que varía de 100.000 a 500.000 células / ml) por pocillo en una placa de fondo en U de 96 pocillos y añadir TLR7 agonista ( Imiquimod, concentración final: 2,5 mg / ml) o TLR9 agonista (ODN CpG-A 2,216, concentración final: 5 mM). Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 18-22 hr y procesarlos en una manera similar a los co-cultivos se describen a continuación. Incubar co-cultivos a 37 ° C y 5% de CO2 durante 18 a 22 horas, y luego transferir a una placa de 96 pocillos-V inferior. Centrifugar durante 5 min a 400 x g. Traslado sobrenadantes a una placa de fondo plano de 96 pocillos. Los sobrenadantes pueden ser almacenadas a -80 ° C o se utilizan para la detección de IFN de tipo I inmediatamente. Resuspender las células co-cultivaron en 2% de paraformaldehído y analizarlos usando citometría de flujo. Debido a diferencias en el tamaño y la granulación, las células MT4 se distinguen fácilmente de PBMCs o PDC en función de su dispersión lateral (SS) frente a la dispersión frontal (FS) perfiles. Si las células T primarias se utilizan como células diana infectadas, estos pueden ser teñidas con un colorante de rastreador celular, tal como CSFE, para co-cultivo antes. Medición de bioactivo tipo I IFN utilizando células reportero beta HEK-Blue IFN-a /. Nota: Estas células fueron generados por transfección estable de células HEK293 con los genes STAT2 y irf9 humanos para obtener un tipo completamente activo I IFN vía de señalización. También contienen la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) gen informador bajo el control de la IFN-α / ß promotor inducible ISG54. La estimulación de estas células con IFN de tipo I activa el JAK / STAT / ISGF3 vía e induce la producción de SEAP. Mantener las células HEK-Blue IFN-α / ß en DMEM suplementado con 10% FBS. Placa de ellos a una densidad de 50.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos, en un volumen final de 180 microlitros. Añadir 20 l de co-cultivo sobrenadante a cada pocillo por duplicado. Cada placa también requiere un conjunto de controles estándar interno (IFN humano, concentración final de 100 U / ml a 2.500 U / ml). Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO2 durante 18H -22. Determinar los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina utilizando solución de QUANTI azul, que cambia de rosa a púrpura / azul en presencia de la enzima. Preparar QUANTI-Blue siguiendo las recomendaciones del fabricante. Añadir 180 l de esta solución a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A cada pocillo también añadir 20 l de los sobrenadantes de células HEK-Blue IFN-α / ß inducidas, y se incuba la placa en una incubadora a 37 ° C hasta que el color se desarrolla en los pocillos de control estándar de IFN. Evaluar los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620 a 655 nm y determinar la concentración de IFN de tipo I por extrapolación de la parte lineal de la curva estándar de IFN.