Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4⁺ Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em> Экс естественных</em> Совместное культивирование системы.

Общие замечания Важно, чтобы держать клеток в культуре без антибиотика, так как даже контролируемые бактериальные инфекции может воспринимать РВМС. Такой чувствительный бактериальных компонентов будет вызывать продукцию интерферона фона, что не может быть отличимо от вызваны конкретной ВИЧ-1 зондирования. Кроме того, все клетки должны регулярно проверяться на отсутствие загрязнения микоплазмой. Всегда используйте эндотоксина решения, когда это возможно. Проточной цитометрии характеристика различных клеток, которые будут использоваться в совместных культурах (РВМС, PDCs, МТ4 и CD4 + Т-клетки) является необязательным этапом, но настоятельно рекомендуется, так как это может дать ценную информацию, необходимую для правильной интерпретации данного эксперимента. 1. Подготовка инфицированных клеток-мишеней Поддержание клеток человека линии CD4 + T MT4 в RPMI 1640 Mediс добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), называемый с этого момента, как RPMI-1640 полной среде. Выделение первичных CD4 + Т-клеток. Изолировать мононуклеарных клеток из периферической крови человека центрифугированием в градиенте плотности. Изолировать CD4 + Т-лимфоциты, используя CD4 + Т-клеток негативный отбор комплект, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Активация CD4 + Т-лимфоцитов PHA-L (5 мкг / мл) в течение 48 ч, а затем поддерживать клетки в RPMI-1640 среде, дополненной полного рекомбинантным IL-2 (100 ед / мл). Инфекция первичный Т-клетки 5 дней после изоляции. Заражение клеток-мишеней (МТ4 T клеточной линии или гетерологичных первичных CD4 + Т-клеток). За два дня до совместного культивирования, заражают Т-клеток ВИЧ-1 вируса. В конкретном примере, описанном здесь были использованы pNL4.3-GFP_ires_Nef дикого типа (WT) или pNL4.3-GFP_ires_Nef дельта ВПУ (dVpu) вирусы. Эти штаммы представляют вирусные GREан флуоресцентный белок (GFP), отмеченные звёздочкой изогенные инфекционных молекулярные клоны, отличающиеся только в их способности выражать ВПУ. Используйте различные кратности инфекции (MÕIS) и выберите культур с аналогичными уровнями инфекции для сокультурах. В день совместного культивирования, определить процент GFP + клеток с помощью проточной цитометрии в качестве маркера инфекции. Используйте только культуры с диапазоном 20-50% инфицированных клеток для совместного культур. Дополнительные шаги: Выполните окрашивание цитометрический потока в этой точке, чтобы оценить поверхностную экспрессию молекул / лигандов интерес, таких как BST2 и CD4. Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 0,5 х 10 6 Т-клеток в 100 мкл промывочного раствора, добавить 1 мкл анти-CD4_PerCP / Cy5.5 и 1 мкл анти-BST2_A660. Инкубируйте пробирки в течение 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора. Если исследования направлены на оценку роли ВПУ-опосредованной BST2 антагонизма, выполнить ВИЧ-1 частицырелиз анализа в это время, как описано выше 15. 2. Выделение и Обогащение Чувствуя клеток (цельная МНПК или обогащенным PDCs) Примечание: При МНПК используются для зондирования, начать изоляцию в течение получаса после сбора час крови и провести его своевременно. Использовать немедленно МНПК для сокультурах или PDC обогащения. Изолировать мононуклеарных клеток из периферической крови человека центрифугированием в градиенте плотности. Необязательный шаг: Выполнение нескольких параметрического окрашивание проточной цитометрии, чтобы подтвердить, что свежевыделенных МНПК содержать различные клеточные клоны при физиологических соотношениях. Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 10 6 РВМС в 100 мкл блокирующего раствора Fc, и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С. После блокирования добавляют 1 мкл анти-CD3_Pacific синий (для Т-клеток), 1 мкл анти-CD14-PE_Texas красный (для миелоидных клеток), 4 мкл анти-BDCA2_APC и 1 мкл анти-ILT7_PE (для PDCs). ВысиживатьТрубы для 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора. Пополните PDCs помощью PDC негативный отбор комплект, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Рекомендуется работать быстро, сохранить клетки холодно, и использовать предварительно охлаждают решения. Это позволит предотвратить укупорки антител на поверхности клеток и неспецифической маркировки клеток, а также обеспечения максимальной активности PDC. Выполнение нескольких параметрический анализ проточной цитометрии из свежеизолированных PDCs, чтобы подтвердить чистоту, процент обогащения, и относительные количества pDC- конкретных поверхностных маркеров (например, ILT7 и BDCA2). Для окрашивания клеточной поверхности, ресуспендируют 10 4 PDCs в 100 мкл блокирующего раствора Fc, и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С. После блокирования добавляют 1 мкл анти-CD3_Pacific синий, 1 мкл анти-CD14_PE_Texas красный, 4 мкл анти-BDCA2_APC и 1 мкл анти-ILT7_PE. Инкубируйте пробирки в течение 45 мин при 4 ° С, а затем промывали проточной цитометрии промывочного раствора (PBS, 5мМ ЭДТА, 5% FBS). Минимум 40% PDC чистоты рекомендуется (если исходный материал имеет 0,4% PDC, это было бы эквивалентно 100-кратному обогащению). 3. Совместное культивирование инфицированных CD4 + Т-клеток и клеток зондирования (Whole МНПК или обогащенным PDCs) Смешайте 220 мкл РВМС (разбавленный на 850000 клеток / мл) или 220 мкл PDCs (при концентрации в диапазоне от 100000 до 500000 клеток / мл) с 30 мкл инфицированных Т-клеток (разбавленный в 10 6 клеток / мл) на лунку в П-96 также нижняя пластина. В качестве контроля, пластины МНПК или PDCs и Т-клеток в одиночку. Регулировка громкости в хорошо до 250 мкл с RPMI 1640 полной среде. Оценка клеточные ответы на известной агониста путей TLR7 и TLR9. С этой целью пластина 220 мкл РВМС (разбавленного до 850000 клеток / мл) или 200 мкл PDCs (при концентрации в диапазоне от 100000 до 500000 клеток / мл) на лунку в U-нижней 96-луночный планшет и добавить агонист TLR7 ( Имиquimod, конечная концентрация: 2,5 мкг / мл) или агонист TLR9 (ODN 2 216 CpG-A, конечная концентрация: 5 мкМ). Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 18-22 ч и обрабатывать их аналогично совместного культивировани, описанных ниже. Выдержите сопутствующих культур при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 18-22 ч, а затем передавать их на V-дно 96-луночного планшета. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г в. Перевести супернатантами к луночного планшета с плоским дном 96. Супернатанты можно хранить при -80 ° С или используется для обнаружения типа I IFN немедленно. Ресуспендируют совместном культивировании клеток в 2% параформальдегида и анализировать их с помощью проточной цитометрии. Из-за различий в размерах и грануляции, клетки МТ4 легко отличить от МНПК или PDCs на основе их боковой разброс (СС) в сравнении с прямого рассеяния (FS) профилей. Если первичные Т-клетки используются в качестве целевых клеток, инфицированных, они могут быть окрашены в любой следящей клеток красителем, таким как CSFE, до совместного культивирования. Измерение биологически активного типа-I IFN с помощью НЕК-синий ИФН-альфа / бета репортер клетки. Примечание: Эти клетки были получены с помощью стабильной трансфекции клеток НЕК293 с STAT2 и irf9 генов человека, чтобы получить полностью активный IFN типа I сигнального пути. Они также содержат секретируется щелочной фосфатазы (SEAP) ген-репортер под контролем интерферона-альфа / бета индуцируемый промотор ISG54. Стимуляция этих клеток типа I IFN активирует JAK / STAT / ISGF3 путь и индуцирует выработку SEAP. Поддержание НЕК-синий IFN-α / -клеток в DMEM с добавлением 10% FBS. Пластина их при плотности 50000 клеток на лунку в луночный планшет с плоским дном 96, в конечном объеме 180 мкл. Добавьте 20 мкл совместно культурального супернатанта в каждую лунку в двух повторностях. Каждая пластина также требует набора стандартных элементов управления внутренних (человек IFN &, конечная концентрация от 100 ед / мл до 2500 ед / мл). Инкубируйте пластин при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 18-22 Ч. Определить уровни активности щелочной фосфатазы с использованием количественно-синий раствор, который изменяет цвет от розового до фиолетового / синего в присутствии фермента. Подготовка количественно-синий в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Добавить 180 мкл этого раствора в каждую лунку луночный планшет с плоским дном 96. В каждую лунку добавить 20 мкл индуцированных НЕК-синий ИФН-α / -клеток супернатантах, и инкубировать пластины в 37 ° C инкубаторе до цвета не развивается в стандартных контрольных скважин ИФН. Оценка уровней SEAP с помощью спектрофотометра при 620-655 нм и определяют концентрацию типа I IFN путем экстраполяции линейной части калибровочной кривой IFN.