Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected⁺ As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em> Ex vivo</em> Co-cultura do sistema.

Notas gerais É importante manter as células em cultura sem nenhum antibiótico, uma vez que as infecções bacterianas podem ser ainda controlados detectada por PBMC. Tal detecção de componentes bacterianos irá induzir um interferão fundo de produção que não podem ser distinguidas das que desencadeada por específica de HIV-1 de detecção. Além disso, todas as células têm de ser rotineiramente testadas quanto à ausência de contaminação por micoplasma. Sempre use soluções livres de endotoxinas sempre que possível. Por citometria de fluxo caracterização das diferentes células para ser utilizado no processo de co-culturas (PBMC, pDCs, MT4 e células T CD4 +) é um passo opcional, mas altamente recomendada uma vez que pode fornecer informação valiosa necessária para uma interpretação correcta de uma dada experiência. 1. Preparação de células alvo infectadas Manter a linha de células CD4 + T humana MT4 em RPMI 1640 medium suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS), a partir de agora referido como RPMI-1640 completo. Isolamento de células T CD4 + primárias. Isolar as células mononucleares a partir de sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade. Isolar linfócitos T CD4 + usando um kit de selecção negativa de células T CD4 +, seguindo as recomendações do fabricante. Activam linfócitos T CD4 + com PHA-G (5 ug / ml) durante 48 hr e, em seguida, se manter as células em meio RPMI-1640 completo suplementado com IL-2 recombinante (100 U / mL). Primária infectar células T 5 dias após o isolamento. A infecção de células alvo (linha celular MT4 T ou células T CD4 + primárias heterólogos). Dois dias antes do co-cultura, infectar as células T com vírus HIV-1. No exemplo específico descrito aqui foram usadas pNL4.3-GFP_ires_Nef tipo selvagem (WT) ou pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) vírus. Estas estirpes virais representam green proteína fluorescente (GFP) -marked clones moleculares infecciosos isogênicas que diferem apenas na sua capacidade de expressar Vpu. Use diferentes multiplicidades de infecção (MOI) e selecione culturas com níveis semelhantes de infecção para co-culturas. O dia da co-cultura, determinar a percentagem de GFP + células por citometria de fluxo como marcador de infecção. Utilize apenas as culturas com uma gama de 20-50% de células infectadas para co-culturas. Passos opcionais: Execute citometria de fluxo coloração neste momento para avaliar a expressão de moléculas de superfície / ligantes de interesse, como BST2, e CD4. Para a coloração da superfície celular, ressuspender 0,5 x 10 6 células T em 100 ul de solução de lavagem, adicionar 1 ml de anti-CD4_PerCP / Cy5.5 e 1 uL de anti-BST2_A660. Incubar os tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar com citometria de fluxo da solução de lavagem. Se os estudos visam avaliar o papel do antagonismo BST2 Vpu-mediada, executar uma HIV-1 partículaensaio de libertação neste momento como previamente descrito 15. 2. Isolamento e Enriquecimento de células (PBMC Sentindo inteiras ou pDCs enriquecido) Nota: Quando as PBMC são usadas para a detecção, isolamento começar dentro de meia hora após a coleta de sangue e conduzi-la em tempo hábil. Use PBMC imediatamente para colegas de culturas ou pDC enriquecimento. Isolar as células mononucleares a partir de sangue periférico humano por centrifugação em gradiente de densidade. Etapa opcional: Execute coloração multi-paramétrico de citometria de fluxo para confirmar que os PBMC isolados de fresco contêm as diferentes linhagens celulares em razões fisiológicas. Para a coloração da superfície celular, ressuspender 10 6 PBMC em 100 ul de solução de bloqueio de Fc, e incubar durante 15 min a 4 ° C. Após o bloqueio, adicionar 1 ul de anti-CD3_Pacific azul (para células T), 1 uL de anti-CD14-PE_Texas Red (para células mielóides), 4 ul de anti-BDCA2_APC e 1 uL de anti-ILT7_PE (por pDCs). Incubaros tubos durante 45 min a 4 ° C, antes da lavagem com citometria de fluxo da solução de lavagem. Enriqueça pDCs usando um kit de seleção negativa pDC, seguindo as recomendações do fabricante. Recomenda-se rapidamente ao trabalho, manter as células frio, e usar soluções pré-arrefecida. Isto impedirá que o capeamento de anticorpos na superfície da célula e rotulagem de células não-específica, bem como assegurar a actividade máxima pDC. Realizar análise de citometria de fluxo multi-paramétrica dos pDCs recentemente isolados para confirmar a pureza, a percentagem de enriquecimento, e quantidades relativas de pdc- marcadores de superfície específica (como ILT7 e BDCA2). Para a coloração da superfície celular, ressuspender 10 4 pDCs em 100 ul de solução de bloqueio de Fc, e incubar durante 15 min a 4 ° C. Após o bloqueio, adicionar 1 ml de anti-CD3_Pacific Azul, 1 jul de anti-CD14_PE_Texas Vermelho, 4 jul de anti-BDCA2_APC e 1 ml de anti-ILT7_PE. Incubar os tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar com citometria de fluxo da solução de lavagem (PBS, 5mM de EDTA, 5% de FBS). Um mínimo de 40% de pureza PDC é recomendado (se o material de partida tem 0,4% pdc e isso seria equivalente a um enriquecimento de 100 vezes). 3. Co-cultura de células infectadas T CD4 + e sensoriamento células (PBMC inteiras ou pDCs enriquecido) Misturar 220 mL de PBMC (diluído a 850.000 células / ml) ou 220 ul de pDCs (a uma concentração variando de 100.000 a 500.000 células / ml) com 30 ul de células T infectadas (diluído a 10 6 células / ml) por poço em um U-bottom placa de 96 poços. Como controlos, as CMSPs de placa ou pDCs e células T isoladamente. Ajustar o volume no poço para 250 ul com meio RPMI 1640 completo. Avaliar respostas celulares ao agonista conhecido da via de TLR7 e TLR9. Para este fim, placa 220 uL de PBMC (diluído a 850.000 células / ml) ou 200 ul de pDCs (a uma concentração variando de 100.000 a 500.000 células / ml) por poço em uma de fundo em U de 96 poços e adicionar TLR7 agonista ( Imiquimod, concentração final: 2,5 ug / ml) ou TLR9 agonista (ODN CpG-A 2216, concentração final: 5 uM). Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18-22 horas e processá-los de um modo semelhante às co-culturas descritas abaixo. Incubar co-culturas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18-22 horas, e, em seguida, transferi-los para um fundo em V de 96 poços. Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Transfira os sobrenadantes para uma de fundo plano de 96 poços. Os sobrenadantes podem ser armazenadas a -80 ° C ou usado para a detecção de IFN tipo I imediatamente. Ressuspender as células co-cultivadas em 2% de paraformaldeído e analisadas utilizando citometria de fluxo. Devido a diferenças de tamanho e de granulação, células MT4 são facilmente distinguidos dos PBMC ou pDCs com base em seu lado de dispersão (SS) versus a frente-de dispersão (FS) perfis. Se as células T primárias são utilizadas como células alvo infectadas, estas podem ser marcadas com qualquer corante rastreador de células, tais como CSFE, antes da co-cultura. Medição de bioactivo do tipo I IFN, utilizando células HEK repórter de p-Azul IFN-a /. Nota: Estas células foram geradas por transfecção estável de células HEK293 com os genes STAT2 e IRF9 humanos para se obter um tipo totalmente activo I IFN via de sinalização. Eles também contêm o gene repórter de fosfatase alcalina segregada (SEAP), sob o controlo do IFN-α / p promotor indutível ISG54. A estimulação destas células com IFN tipo I activa a via JAK / STAT / ISGF3 via e induz a produção de SEAP. Manter as células HEK-Azul de IFN-α / p em DMEM suplementado com FBS a 10%. Placa-los a uma densidade de 50.000 células por cavidade em uma de fundo plano de 96 poços, num volume final de 180 ul. Adicionar 20 ul de co-cultura sobrenadante de cada poço em duplicado. Cada chapa também requer um conjunto de controlos do padrão interno (IFNa humano, concentração final de 100 U / ml a 2500 U / mL). Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 18Hr -22. Determinar os níveis de actividade da fosfatase alcalina utilizando uma solução de quanti-azul, o qual muda de cor de rosa a violeta / azul na presença da enzima. Prepare QUANTI Azul seguir as recomendações do fabricante. Adicionar 180 ul desta solução para cada poço de um de fundo plano de 96 poços. Para cada poço também adicionar 20 ul das células sobrenadantes de células HEK-Azul de IFN-α / p induzidas, e incuba-se a placa numa incubadora a 37 ° C até que a cor se desenvolve nos poços de padrão IFN de controlo. Avaliar os níveis de SEAP, utilizando um espectrofotómetro a 620-655 nm, e determinar a concentração de IFN tipo I, por extrapolação a partir da parte linear da curva padrão de IFN.