HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가⁺를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em> 예 생체 내</em> 공동 문화 시스템.

일반 공지 사항 심지어 제어 된 세균 감염은 PBMC를 감지 할 수 있으므로, 어떤 항생제없이 배양에서 세포를 유지하는 것이 중요하다. 세균 등의 센싱 요소는 특정 HIV-1 촬상 트리거 그 구별 될 수없는 배경 인터페론 생산을 유도 할 것이다. 또한, 모든 셀들은 통상적으로 마이코 플라스마 오염의 부재에 대해 시험 할 수있다. 가능하면 항상 독소가없는 솔루션을 사용합니다. 상이한 세포의 유세포 특성화 공동 배양에 사용되는 (PBMC를는 올라가고, MT4 및 CD4 + T 세포)는 선택적 단계이지만, 주어진 실험의 적절한 해석에 필요한 유용한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 추천. 감염된 표적 세포의 제조 (1) RPMI 1640 메디칼 인간의 CD4 + T 세포 라인 MT4 유지RPMI-1640은 완전 배지이라 함, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 주요 CD4 + T 세포의 분리. 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. 제조자의 권고 다음의 CD4 + T 세포를 음성 선별 키트를 사용하여 CD4 + T 림프구를 분리. RPMI-1640 완전 배지에서 48 시간 동안 PHA-L (5 μg의 / ㎖)와 CD4 + T 림프구를 활성화하고 유지하는 세포는 재조합 IL-2 (100 U / ml)로 보충. 차 T 세포 오일 게시물 격리를 감염. 표적 세포 (MT4 T 세포주 또는 일차 이종 CD4 + T 세포)에 감염. HIV-1 바이러스 T 세포를, 문화를 공동 감염 이틀 전에. 여기에 기술 된 특정 실시 예에서 pNL4.3-GFP_ires_Nef 야생형 (WT) 또는 pNL4.3 GFP_ires_Nef 델타 – VPU (dVpu) 바이러스를 사용 하였다. 이 바이러스 균주는 GRE를 나타냅니다형광 단백질 (GFP)는 VPU를 표현하는 능력 만 다른 동종 전염성 분자 클론을 -marked 갖추고 있습니다. 감염 (MOIs)의 다른 다중도를 사용하여 공동 문화에 대한 감염의 비슷한 수준의 문화를 선택합니다. 공동 배양 하루 계측법 감염의 마커로서 유동에 의해 GFP + 세포의 비율을 결정한다. 공동 문화에 대한 20-50% 감염된 세포의 범위 만 문화를 사용합니다. 옵션 단계 : 같은 BST2, 그리고 CD4 같은 관심의 분자 / 리간드의 표면 발현을 평가하는이 시점에서 유세포 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 항 CD4_PerCP / Cy5.5 1 μL 및 안티 BST2_A660 1 μL를 추가 세척 용액 100 ㎕에 0.5 × 106 T 세포를 재현 탁. 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어. 연구가 VPU 매개 BST2 길항 작용의 역할을 평가 대상으로하는 경우, HIV-1 입자를 수행이때 방출 분석은 앞서 설명한 15. 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고)를 감지 2. 분리 및 농축 주 : PBMC를 사용이 감지되면, 채혈 후 반 시간 내에 분리를 시작하고 적시에 그것을 수행. 공동 문화 또는 PDC 농축 즉시 PBMC를 사용합니다. 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. 선택적 단계 : 그 갓 격리 PBMC를 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함 확인하는 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 ㎕에 10 6 된 PBMC를 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루, (골수 세포) 항 CD14-PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL와 (PDC의) 반 ILT7_PE 1 μL (T 세포)의 1 μl를 추가합니다. 품다세척 용액 유동 세포 계측법 세척 전에 4 ° C에서 45 분 동안 튜브,. 제조업체의 권장 사항은 다음 PDC 부정적인 선택 키트를 사용하여 올라가고을 풍부. 그것은, 빠른 작동 차가운 세포를 유지하고, 미리 냉각 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 이는 PDC 최대 활성을 보장뿐만 아니라 세포 표면과 비특이적 세포 표지 항체에 캐핑을 방지 할 것이다. 순도, 농축 비율 (예 : ILT7과 BDCA2 등) pDC- 특정 표면 마커의 상대적인 양을 확인하기 위해 갓 격리 올라가고의 다중 매개 변수 유세포 분석을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 μL에 104 PDCS을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루의 1 μL, 안티 CD14_PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL 및 안티 ILT7_PE 1 μl를 추가합니다. (PBS, 5 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어mM의 EDTA, 5 % FBS). 40 % 순도의 PDC 최소 (출발 물질이 0.4 % PDC가있는 경우, 이는 100 배 농축 동등한 것)를 권장합니다. 감염된 CD4 + T 세포와 감지 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고) 3. 공동 문화 웰당 (106 세포 / ml로 희석) 감염된 T 세포의 30 μL로하여 PBMC를 220 μL 또는 PDCS 220 μL (850,000 세포 / ml로 희석) (100,000 내지 500,000 세포 농도 범위 / ㎖)을 혼합 U-바닥 96 웰 플레이트. 혼자 컨트롤, 판 PBMC를 또는 올라가고 및 T 세포로. RPMI 1640 완전 배지 잘 250 μL의 볼륨을 조절합니다. TLR7 및 TLR9 경로의 알려진 효능에 대한 세포 반응을 평가합니다. 이를 위해, PBMC를 접시 220 μL은 U 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 또는 (100,000 내지 500,000 세포 / ml 범위의 농도에서) PDCS 200 μL (850,000 세포 / ㎖로 희석) 및 (TLR7 작용제를 추가 IMIquimod, 최종 농도 2.5 μg의 / ㎖) 또는 TLR9 작용제 (2,216의 CpG ODN-A, 최종 농도 5 μM). 37 ° C에서 배양 한 세포 및 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안 후술 공동 배양 유사한 방식으로이를 처리한다. 37 ℃에서 동시 배양 물을 인큐베이션하고, 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안, 다음 V 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴다. 400 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. 평면 바닥 96 웰 플레이트에 상층 액을 전송합니다. 상청액을 -80 ℃에서 보관하거나 즉시 타입 I IFN 검출을 위해 사용될 수있다. 2 % 파라 포름 알데히드의 공 배양 세포를 재현 탁하고 유세포 분석기를 사용하여 분석한다. 크기 및 과립의 차이로 인해, MT4 세포는 앞으로 산란 (FS) 프로파일 대 그들의 측면 산란 (SS)를 기반으로 한 PBMC 또는 올라가고 쉽게 구별된다. 프라이 머리 T 세포를 표적으로 감염된 세포를 사용하는 경우, 이들은 같은 CSFE 같은 임의의 셀 추적 염료 종래의 공동 배양을 염색 할 수있다. HEK-블루 IFN-α / β 리포터 세포를 사용하여 생체 활성 타입 I IFN의 측정. 주 : 이러한 세포 I은 신호 전달 경로를 완전히 IFN 활성 형을 얻기 위해 인간 및 STAT2 IRF9 유전자 HEK293 세포의 안정한 형질 감염에 의해 생성되었다. 또한 유도 ISG54 프로모터를 β / IFN-α의 제어하에 분비 알칼리 포스 파타 아제 (SEAP) 리포터 유전자를 포함한다. 유형 I IFN 이러한 세포의 자극은 JAK / STAT / ISGF3 경로를 활성화하고 SEAP의 생산을 유도한다. 10 % FBS 보충 된 DMEM에서 HEK-블루 IFN-α / β 세포를 유지한다. 180 μL의 최종 부피, 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 50,000 세포의 밀도로 그들을 접시. 중복에 각 웰에 공동 배양 상층 액의 20 μl를 추가합니다. 각 판은 내부 표준 컨트롤 세트 (인간 IFNα, 2500 U / ml의 100 U /에서 최종 농도)가 필요합니다. 18 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 플레이트-22의 시간. 효소의 존재 퍼플 / 블루에 핑크에서 변경 정량화 – 블루 용액을 이용하여 알칼리 포스 파타 아제 활성의 수준을 결정합니다. 제조업체의 권장 사항은 다음 정량화 – 블루를 준비합니다. 평면 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에이 용액 180 μl를 추가합니다. 각 웰 또한 유도 HEK-블루 IFN-α / β 세포 상층 액 20 μL를 추가 한 색상 표준 IFN의 대조군 웰에 개발 될 때까지 37 ° C의 배양기에서 배양 플레이트. 620-655 nm에서 분광 광도계를 사용하여 SEAP의 수준을 평가하고 IFN 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽 법에 의해 형-I IFN의 농도를 결정한다.