HIV-1感染CD4の生得センシングを評価⁺使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em>エクスビボ</em>共培養系。

一般的な注意事項 それも、細菌感染を制御したPBMCによって感知することができるので、任意の抗生物質なしに培養中の細胞を維持することが重要です。細菌成分の、このような検出は、特定のHIV-1検知によりトリガーとは区別することができない背景インターフェロン産生を誘導します。さらに、全ての細胞は、日常的にマイコプラズマ汚染の非存在について試験されなければなりません。 可能な限り、常にエンドトキシンフリーソリューションを使用しています。 異なる細胞のフローサイトメトリーの特徴付けは、共培養に使用される（PBMCが、pDCに、MT4及びCD4 + T細胞）はオプションのステップであるが、それは所定の実験の適切な解釈のために必要な貴重な情報を提供することができるので、非常にお勧め。 感染した標的細胞の調製 RPMI 1640メディにヒトCD4 + T細胞株MT4を維持RPMI-1640完全培地としてこれから参照される10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。 一次CD4 + T細胞の単離。 密度勾配遠心分離によりヒト末梢血から単核細胞を単離します。 製造業者の推奨に従って、CD4 + T細胞の陰性選択キットを用いてCD4 + Tリンパ球を単離します。 48時間PHA-LのCD4 + Tリンパ球 （5μg/ mlの）を有効にして、組換えIL-2（100 U / ml）を補充したRPMI-1640完全培地中で細胞を維持します。一次T細胞の5日後の分離に感染します。 標的細胞（MT4 T細胞株または異種の一次CD4 + T細胞）の感染。 共培養の前に二日は、HIV-1ウイルスをT細胞に感染します。ここに記載された特定の例ではpNL4.3-GFP_ires_Nef野生型（WT）またはpNL4.3-GFP_ires_NefデルタのVpu（dVpu）ウイルスが使用されました。これらのウイルス株は、GREを表します蛍光タンパク質（GFP）専用のVpuを表現する能力のみが異なる同質遺伝子型感染性分子クローンを-marked。 感染の異なる多重度（MOIで）を使用し、共培養のための感染症の同様のレベルでの文化を選択します。共培養の日、感染のマーカーとしてフローサイトメトリーによりGFP +細胞のパーセンテージを決定します。共培養のために20〜50％に感染した細胞の範囲でのみの文化を使用してください。 オプションのステップ：そのようなBST2、およびCD4のような目的の分子/リガンドの表面発現を評価するために、この時点でフローサイトメトリー染色を実行します。細胞表面染色のために、抗CD4_PerCP / Cy5.5の1μLのと抗BST2_A660の1μlを添加、洗浄溶液100μlの0.5×10 6 T細胞を再懸濁します。フローサイトメトリーの洗浄溶液で洗浄する前に、4℃で45分間チューブをインキュベートします。研究はのVpu媒介BST2拮抗作用の役割を評価することを目的としている場合は、HIV-1粒子を行いますこの時の放出アッセイは、以前に15を説明しました。 検出セル（全体のPBMCまたは濃縮のpDC）の2単離と濃縮注：PBMCを感知するために使用される場合、血液採取後30分以内に分離を開始し、タイムリーな方法でそれを行います。共培養またはpDCの濃縮のためにすぐのPBMCを使用してください。 密度勾配遠心分離によりヒト末梢血から単核細胞を単離します。 オプションの手順：その新たに単離したPBMCを、生理学的比率で異なる細胞系統を含んで確認するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー染色を実行します。細胞表面染色のためには、Fcブロッキング溶液100μlで10 6のPBMCを再懸濁し、4℃で15分間インキュベートします。ブロッキング後、抗CD3_Pacificブルー、（骨髄細胞）抗CD14-PE_Texasレッドの1μL、抗BDCA2_APC4μlのと（pDCに用）抗ILT7_PEの1μL（T細胞）の1μlを添加します。インキュベートフローサイトメトリーの洗浄溶液で洗浄する前に、4℃で45分間チューブ。 メーカーの推奨次のpDC陰性選択キットを使用したpDCを、豊かに。これは、高速に動作冷たい細胞を維持し、予め冷却したソリューションを使用することをお勧めします。これは最大のpDCの活動を確保するだけでなく、細胞表面と非特異的な細胞標識に対する抗体のキャッピングを防ぐことができます。 純度、濃縮の割合、および（例えばILT7とBDCA2など）pDC-特定の表面マーカーの相対量を確認するために、新たに単離したpDCのマルチパラメトリックフローサイトメトリー分析を実行します。細胞表面染色のためには、Fcブロッキング溶液100μlで10 4のpDCを再懸濁し、4℃で15分間インキュベートします。ブロッキング後、抗CD3_Pacificブルーの1μL、抗CD14_PE_Texas赤、抗BDCA2_APCの4μLおよび抗ILT7_PEの1μLの1μlを添加します。フローサイトメトリーの洗浄溶液（PBS、5で洗浄する前に、4℃で45分間チューブをインキュベートmMのEDTA、5％FBS）。 40％のpDC純度の最小値は（出発物質が0.4％のpDCを持っている場合、これは100倍の濃縮に相当します）をお勧めします。 感染したCD4 + T細胞および検出セル（全体のPBMCまたは濃縮のpDC）の3共培養にウェルあたり（10 6細胞 / mlに希釈した）感染したT細胞の30μlの（100,000〜500,000個の細胞/ mlの範囲の濃度で）（85万細胞/ mlに希釈した）PBMCの220μlあるいはたpDCの220μLを混合U底96ウェルプレート。 単独でコントロールプレートのPBMCまたはのpDCおよびT細胞など。 RPMI 1640完全培地でウェルに250μlの音量を調整します。 TLR7およびTLR9経路の既知のアゴニストに対する細胞応答を評価します。この目的を達成するために、PBMCのプレート220μlをU底96ウェルプレートにウェル当たりまたは（10万〜500,000細胞/ mlの範囲の濃度で）pDCに200μlの（85万細胞/ mlで希釈した）および（TLR7アゴニストを追加イミquimod、最終濃度は2.5μg/ ml）またはTLR9アゴニスト（ODN 2216のCpG-A、最終濃度：5μM）。 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO 2で 18-22時間、下記の共培養と同様の方法でそれらを処理します。 18-22時間37℃で共培養し、5％CO 2でインキュベートし、その後、V底96ウェルプレートに移します。 400×gで5分間遠心。 平底96ウェルプレートに上清を移します。上清を-80℃で貯蔵するか、即座にI型IFNの検出に使用することができます。 2％パラホルムアルデヒド中で共培養した細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを用いてそれらを分析。サイズと顆粒化の違いによる、MT4細胞は、前方散乱（FS）プロファイル対それらの側方散乱（SS）に基づいたPBMCまたはpDCを容易に区別しています。一次T細胞を対象に感染した細胞として使用される場合、これらは、共培養の前に、例えば、CSFEとして、任意の細胞追跡色素で染色することができます。 HEK-ブルーIFN-α/βレポーター細胞を用いた生物活性I型IFNを測定します。 注：これらの細胞は、Iシグナル伝達経路IFN完全に活性型を得るために、ヒトおよびSTAT2 IRF9遺伝子をHEK293細胞の安定なトランスフェクションによって作製しました。彼らはまた、IFN-α/β誘導性ISG54プロモーターの制御下で分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）レポーター遺伝子を含みます。 I型IFNとのこれらの細胞の刺激は、JAK / STAT / ISGF3経路を活性化し、SEAPの産生を誘導します。 10％FBSを補充したDMEM中で、HEK-ブルーIFN-α/β細胞を維持します。 180μlの最終体積で、平底96ウェルプレート中ウェルあたり50,000細胞の密度で、それらをプレート。 重複して各ウェルに共培養上清の20μlのを追加します。各プレートは、内部標準コントロール（ヒトIFNα、2500 U / mlの100 U /からの最終濃度）のセットが必要です。 18のために37℃でプレートを、5％CO 2でインキュベート-22時間。 酵素の存在下で紫/青にピンクから変更定量化・ブルー溶液を用いて、アルカリホスファターゼ活性のレベルを決定します。製造元の推奨に従って定量化・ブルーを用意。平底96ウェルプレートの各ウェルに、この溶液180μLを加えます。それぞれによくも誘発されたHEK-ブルーIFN-α/β細胞上清20μlのを追加し、色を標準IFN対照ウェルに発症するまで、37℃のインキュベーターでプレートをインキュベートします。 620から655 nmで分光光度計を用いてSEAPのレベルを評価し、IFN標準曲線の直線部分から外挿してI型IFNの濃度を決定します。