Valutare l'innato rilevamento dell'infezione da HIV-1 CD4 infetti⁺ Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em> Ex vivo</em> Sistema di co-coltura.

Note generali È importante mantenere cellule in coltura senza antibiotici, poiché le infezioni batteriche anche controllati possono essere percepiti da PBMC. Tale rilevazione di componenti batteriche indurrà uno sfondo la produzione di interferone, che non può essere distinto da quello innescato da specifici HIV-1 di rilevamento. Inoltre, tutte le cellule devono essere regolarmente testato per l'assenza di contaminazione da micoplasma. Usare sempre soluzioni senza endotossine quando possibile. Citometria a flusso caratterizzazione delle diverse cellule da utilizzare in co-colture (PBMC, pDCs, MT4 e cellule T CD4 +) è un passaggio facoltativo, ma altamente consigliata dato che può fornire preziose informazioni necessarie per la corretta interpretazione di un dato esperimento. 1. Preparazione di cellule bersaglio infette Mantenere umano linea di cellule CD4 + T MT4 in RPMI 1640 mediun addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), cui d'ora in poi come RPMI-1640 terreno completo. L'isolamento di cellule T CD4 + primaria. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Isolare linfociti T CD4 + utilizzando un kit di selezione negativa cellule T CD4 +, seguendo le raccomandazioni del costruttore. Attiva linfociti T CD4 + con PHA-L (5 mg / ml) per 48 ore e poi mantenere cellule in RPMI-1640 integrato con terreno completo ricombinante IL-2 (100 U / ml). Infettare primaria cellule T 5 giorni dopo l'isolamento. L'infezione di cellule bersaglio (linea di cellule MT4 T o cellule eterologhe primarie T CD4 +). Due giorni prima di co-coltura, infettare le cellule T con virus HIV-1. Nell'esempio specifico qui descritto sono stati utilizzati pNL4.3-GFP_ires_Nef wild type (WT) o pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus. Questi ceppi virali rappresentano greit proteina fluorescente (GFP) segnata con cloni molecolari infettivi isogeni che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu. Utilizzare diverse molteplicità di infezione (MOI) e selezionare colture con livelli simili di infezione per i co-culture. Il giorno della co-coltura, determina la percentuale di GFP + cellule mediante citometria a flusso come marcatore di infezione. Utilizzare solo le culture, con un intervallo di 20-50% cellule infette per co-culture. Passaggi facoltativi: Eseguire citometria a flusso colorazione a questo punto per valutare l'espressione superficiale di molecole / ligandi di interesse come BST2, e CD4. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 0,5 x 10 6 cellule T in 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di anti-CD4_PerCP / Cy5.5 e 1 ml di anti-BST2_A660. Incubare le provette per 45 min a 4 ° C, prima di lavare con citofluorimetria soluzione di lavaggio. Se gli studi sono volti a valutare il ruolo di Vpu mediata antagonismo BST2, eseguire un HIV-1 particellasaggio di rilascio in questo momento come descritto in precedenza 15. 2. Isolamento e arricchimento delle celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) Nota: quando PBMC vengono utilizzati per il rilevamento, avviare isolamento all'interno mezz'ora dopo la raccolta del sangue e condotta in modo tempestivo. Utilizzare immediatamente PBMC per co-culture o pDC arricchimento. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Passaggio facoltativo: Eseguire multi-parametrica citometria a flusso colorazione a confermare che i PBMC appena isolate contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 6 PBMC in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific blu (per le cellule T), 1 ml di anti-CD14-PE_Texas rosso (per le cellule mieloidi), 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE (per pDCs). Covaretubi per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio. Arricchisci pDCs utilizzando un kit di selezione negativa pDC, seguendo le raccomandazioni del costruttore. Si raccomanda di lavorare velocemente, mantenere le cellule freddo, e utilizzare soluzioni pre-raffreddati. Questo consentirà di evitare il livellamento di anticorpi sulla superficie delle cellule e l'etichettatura delle cellule non specifici e garantendo massima attività PDC. Eseguire multi-parametrica citometria a flusso delle pDCs appena isolate per confermare la purezza, la percentuale di arricchimento, e quantità relative di pDC- marcatori di superficie specifici (come ILT7 e BDCA2). Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 4 pDCs in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific Blu, 1 ml di anti-CD14_PE_Texas Rosso, 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE. Incubare le provette per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Si raccomanda un minimo di 40% di purezza PDC (se il materiale di partenza è lo 0,4% pDC, questo sarebbe equivalente a un arricchimento 100 volte). 3. Co-coltura di cellule infettate T CD4 + e celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) Miscelare 220 ​​ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 220 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) con 30 ml di cellule T infettate (diluiti a 10 6 cellule / ml) per pozzetto in una piastra ben U-bottom 96. Come controlli, PBMC piastra o pDCs e cellule T da solo. Regolare il volume in ben 250 microlitri con RPMI 1640 terreno completo. Valutare risposte cellulari agonisti nota dei percorsi TLR7 e TLR9. A tal fine, piastra 220 ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 200 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) per pozzetto in una U-bottom 96 pozzetti e aggiungere TLR7 agonisti ( Imiquimod, concentrazione finale: 2,5 mg / ml) o TLR9 agonisti (ODN 2216 CpG-A, concentrazione finale: 5 micron). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 ore ed elaborarli in un modo simile a co-colture di seguito descritte. Incubare co-colture a 37 ° C e 5% di CO 2 per 18-22 ore, e poi trasferirli su un piatto ben 96 V-parte inferiore. Centrifugare per 5 min a 400 x g. Trasferimento surnatanti di una piastra ben a fondo piatto 96. Supernatanti possono essere conservati a -80 ° C o utilizzati per il rilevamento di tipo I IFN subito. Risospendere le cellule co-coltivate in 2% paraformaldeide e analizzarli in citometria a flusso. A causa delle differenze in termini di dimensioni e di granulazione, le cellule MT4 sono facilmente distinguibili da PBMC o pDCs in base al loro fianco scatter (SS) rispetto forward-scatter (FS) profili. Se le cellule T primarie sono utilizzate come cellule bersaglio infettate, questi possono essere colorati con il colorante inseguitore cellulare, quali CSFE, prima della co-coltura. Misura di bioattivo di tipo I IFN utilizzando cellule beta giornalista HEK-Blu-IFN alfa /. Nota: Queste cellule sono stati generati da trasfezione stabile di cellule HEK293 con i geni stat2 e IRF9 umane per ottenere un tipo completamente attivo IFN percorso di segnalazione. Essi contengono anche la fosfatasi alcalina secreta (SEAP) gene reporter sotto il controllo di IFN-α / ß inducibile ISG54 promotore. La stimolazione di queste cellule di tipo I-IFN attiva la JAK / STAT / ISGF3 pathway e induce la produzione di SEAP. Mantenere le cellule HEK-Blue IFN-α / ß in DMEM supplementato con 10% FBS. Li piastra a una densità di 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a fondo piatto ben 96, in un volume finale di 180 microlitri. Aggiungere 20 ml di co-coltura supernatante in ciascun pozzetto in duplicato. Ciascuna piastra richiede anche una serie di controlli standard interno (IFNα umana, concentrazione finale da 100 U / ml a 2500 U / ml). Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 Ore. Determinare i livelli di attività di fosfatasi alcalina con soluzione QUANTI-Blue, che cambia dal rosa al viola / blu in presenza dell'enzima. Preparare QUANTI-Blue seguendo le raccomandazioni del costruttore. Aggiungere 180 ml di questa soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto ben 96. Per ogni bene aggiungere anche 20 l di HEK-Blue IFN-α / beta cellule sopranatanti indotti, e incubare la piastra a 37 ° C incubatore fino colore si sviluppa nei pozzetti di controllo IFN standard. Valutare livelli di SEAP utilizzando uno spettrofotometro a 620-655 nm e determinare la concentrazione di IFN di tipo I per estrapolazione dalla parte lineare della curva standard IFN.