Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt.
HIV-1 angeborenen Erfassungs erfordert direkten Kontakt der infizierten CD4 + T-Zellen mit dendritischen Zellen plasmacytoid (pDC). Um diesen Vorgang zu untersuchen, können die hier beschriebenen Protokolle verwenden Frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) oder plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC), um Infektionen in entweder T-Zelllinie (MT4) oder heterolog primären CD4 + -T-Zellen zu erfassen. Um eine einwandfreie Sensor gewährleisten, ist es wesentlich, dass PBMC werden sofort nach der Blutentnahme und dass eine optimale Prozentsatz von infizierten T-Zellen verwendet werden, isoliert. Weiterhin kann multiparametrischer durchflusszytometrische Färbung verwendet werden, um zu bestätigen, dass PBMC-Proben enthalten, die verschiedenen Zelllinien bei physiologischen Verhältnissen. Eine Reihe von Kontrollen können auch enthalten sein, um die Lebensfähigkeit und Funktionalität pDCs bewerten. Diese umfassen das Vorhandensein spezifischer Oberflächenmarker, die Beurteilung zellulären Reaktionen auf bekannte Agonist des Toll-like Rezeptoren (TLR) Wege und Bestätigen eines fehlenden sponzeitigen Typ-I-Interferon (IFN) Produktion. In diesem System sind frisch isolierte PBMC oder pDCs kokultiviert mit HIV-1 infizierten Zellen in 96-Well-Platten für 18-22 Std. Überstände dieser Co-Kulturen werden dann verwendet, um den Gehalt an bioaktiven Typ-I-IFNs durch die Überwachung der Aktivierung des ISGF3 Wegs in HEK-Blau IFN-α / β-Zellen zu bestimmen. Vor und während der Cokultur Bedingungen können Zielzellen unterzogen werden, um durchflusszytometrische Analyse, um eine Anzahl von Parametern, einschließlich der Anteil der infizierten Zellen, Werte spezifischer Oberflächenmarker, und Differenz Töten von infizierten Zellen zu bestimmen. Obwohl diese Protokolle wurden ursprünglich entwickelt, um Typ-I-IFN-Produktion folgen, könnten sie möglicherweise verwendet, um andere Imuno-modulatorische Moleküle aus pDCs veröffentlicht zu untersuchen und weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen, die HIV-1 angeborenen Erkundung gewinnen werden.
Typ-I-IFN-Herstellung pDCs stellen die erste Verteidigungslinie gegen virale Infektionen, und als solche dienen als wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immun 1. Während zellfreien HIV-1-Partikeln nur schlecht durch das angeborene Immunsystem erkannt werden HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen wirksam durch pDCs 2 abgetastet. Der Sensormechanismus erfordert einen anfänglichen Kontakt zwischen dem viralen Hüllglycoprotein (gp120) an der Oberfläche der infizierten T-Zellen und CD4-Moleküle auf dem PDC, das dann durch Viruserfassung und Internalisierung durch das PDC gefolgt. Nachfolgende Erkennung der übertragenen HIV-1-RNA durch TLR7 löst die Aktivierung der Myd88 / IRF7 Weges und führt den Typ-I-IFN-Produktion 3 letztendlich. Wichtig ist, dass die zweite Erfassungswegs in pDCs vorhanden, die von TLR9 vermittelt wird, wird durch die Interaktion des viralen Glycoproteins gp120 inhibiert wird, mit dem PDC-spezifische Oberflächenmarker BDCA2 4.
<p class="jove_content"> Die TLR7 und TLR9 Erfassungswege von pDC potenziell negativ durch den Eingriff der BST2 (auch Tetherin oder CD317 bezeichnet) mit einer anderen pDC-spezifische Oberfläche inhibitorischen Rezeptor genannt ILT7 5 moduliert werden. BST2 in hohem Ausmaß an der Oberfläche der pDCs und einige Krebszellen exprimiert wird, aber bei relativ niedrigen Konzentrationen in anderen Zelltypen, wie B-Zellen, Makrophagen und T-Zellen. Wichtiger ist, kann BST2 von Typ-I-IFN in einer Reihe von transformierten Zelllinien als auch in primären Zellkulturen von humanen und murinen Ursprungs 6 induziert werden. Abgesehen von ihrer immunregulatorische Funktion, wurde vor kurzem festgestellt BST2 um die Freisetzung von HIV-1 hemmen und anderen umhüllten Viruspartikel durch Vernetzen naszierenden Viruspartikel auf den infizierten Zelloberfläche 7. Im Fall von HIV-1, wurde die viruskodierte akzessorisches Protein U (Vpu) gezeigt, als BST2 Antagonist fungieren. Es wird angenommen, dass Vpu downregulates BST2 von der Zelloberfläche von HIV-1-infizierten Zellen, die Seite der Leineing Aktivität und als Ergebnis verbessert Virusfreisetzung und verbreiten 7, auch wenn dieser Begriff wurde in Frage gestellt 8,9. In Abwesenheit von Vpu, eine große Anzahl von voll ausgebildet und ausgereifte Nachkommen HIV-1-Partikel werden an der Zelloberfläche zurückgehalten wird. Ob diese tethered Partikel könnten wirksame Ziele für Immunsensor stellen nach wie vor eine offene Frage. Außerdem ist unklar, ob Vpu könnte Typ-I-IFN-Produktion von pDCs dysregulate durch Modulation Oberfläche BST2 Ebenen.Frühe Studien zur HIV-1-Erfassung zu beurteilen wurden unter Verwendung von zellfreien HIV-1-Partikeln, die im allgemeinen schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 3,10-12 betrachtet werden durchgeführt. Da die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass PBMCs und pDCs HIV-infizierte CD4 + T-Lymphozyten 2,13,14 effizient zu erfassen, beschreiben wir hier eine einfache Methode, um angeborenen Antworten durch pDCs bei Erkennung von HIV-1-infizierten Zellen in vitro ausgelöst messen.
Die hier beschriebenen Protokolle messen Erfassen von T-Zellen mit GFP-markierten HIV-1-Viren, die nur in ihrer Fähigkeit, Vpu exprimieren unterscheiden, wie in unserem aktuellen Bericht 18 beschrieben infiziert. Allerdings können diese Verfahren leicht modifiziert werden, um Erfassung von unmarkierte Viren sowie Viren, denen anderen viralen Genen, die potentiell modulieren können angeborene Sensor studieren. Wenn die verwendeten nicht GFP exprimieren Viren, sollte der Anteil der infizierten Zielzellen durch andere Mittel vor der Ko-Kultur, wie p24 (Kapsid) intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie oder durch p24-ELISA bestimmt werden. Darüber hinaus können diese Protokolle mit unterschiedlichen Ziel T-Zellen, einschließlich einer Vielzahl von verfügbaren Zelllinien und primäre Zellen verwendet werden.
Die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren weisen eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu den frühen Methoden zur Behandlung von HIV-1-Erfassung zu studieren. In erster Linie wurde von einer Reihe von Gruppen, die zellfreie HIV-1-p etabliertArtikel sind schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 2,13,14. Weiterhin verlassen frühen Studien bei älteren IFN ELISA-basierten Verfahren, die Menge an Typ-I-IFN produziert quantifizieren. Eine Beschränkung dieser Detektionstechnik ist, dass die meisten älteren IFN alpha ELISA-Kits messen nur eine Art von IFN alpha, während mit Blick auf die anderen Arten von IFN alpha und IFN & beta. Der Einsatz der beschriebenen Reporterzelllinien überwindet diese Einschränkung, da die Konzentration aller bioaktiven Formen des menschlichen Typ I-IFNs auf einmal gemessen werden. Die Technik ist sehr empfindlich, weniger teuer als die neue Generation von IFN-ELISA-Kits und für viele Spender große Mengen an Typ-I-IFN leicht erkannt werden können. Dennoch kann dieses Protokoll leicht zur Verwendung mit anderen Typ-I-IFN-Ausleseverfahren wie ELISAs angepasst werden.
Kritischen Schritte: Es ist wichtig, dass die Qualität aller zellulären Komponenten (beide Ziele und Effektoren) streng kontrolliert werden. Mögliche Kontamination, auch wenn asymptischen, muss überwacht und gesteuert werden. Wie bereits erwähnt, Antibiotikum gesteuerten asymptomatischen bakteriellen Kontamination und möglicherweise andere intrazelluläre Pathogene, wie Mycoplasmen, können ähnliche Immunreaktionen gegen das nach dem HIV-1-Infektion, nämlich Produktion von Typ-I-IFN beobachtet Einsen erzeugen. Darüber hinaus müssen alle Reagenzien frei von LPS oder andere potenzielle Endotoxine zu sein. Ebenso ist die Überwachung der PBMCs und pDCs auch wichtig, da die menschliche Proben oft durch darunterliegenden laufenden Infektionen, die normalen Fühl beeinträchtigen kann grundiert werden. Wir empfehlen, immer einschließlich der vorgeschlagenen negativen Kontrollen, wie Fehlen von Zielzellen als auch Co-Kulturen mit mock-infizierten Zellen. Lebensfähigkeit infizierter Zellen ist auch wichtig für die richtige pDC Erkundung seit Typ-I-IFN haben noch keine Co-Kultur mit apoptotischen Zellen 2,14 hergestellt.
Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die Notwendigkeit für frisch isolierte primäre Zellen. Dieses Verfahren wurde nichtgetestet mit PBMCs oder pDCs, die entweder zuvor eingefroren oder in Kultur gehalten wurden. Die Isolierung von PBMCs ist arbeitsintensiv und diese Zellen haben eine sehr begrenzte Lebensdauer. Darüber hinaus sollten Standardprotokolle zum Schutz vor durch Blut übertragbaren Erreger verwendet werden, während der Arbeit mit menschlichem Blut. Oft gibt es mehrere Quellen der Variabilität mit Arbeit verbunden mit frisch isolierten menschlichen Zellen. Unter ihnen sind die verschiedenen Verfahren durchgeführt, um diese Zellen zu isolieren und die geerbte Variabilität vom Spender zu Spender aufgetreten. Während es unmöglich ist, um die Variabilität unter den Spender zu vermeiden, ist die Verwendung der vorgeschlagenen positive Kontrollen, wie Mess Reaktion auf bekannte Agonisten des TLR7 und TLR9 Wege, einen wichtigen internen Kontrolle für diese Experimente zu schaffen. Wir haben beobachtet, dass eine robuste Reaktion auf Agonisten des TLR9-Weg konnte ein gesundes pDC Antwort korreliert werden, während ein reaktions TLR7 Weg wird für eine richtige Antwort gegen HIV-1 3 erforderlich.
<p class = "jove_content"> Basierend auf Beobachtungen von uns gemacht und andere 2, Anreicherung von pDCs aus PBMCs ist häufig nicht erforderlich. Wenn die Versuchsplanung erfordert (zum Beispiel im Kontext, in dem Verarmungs spezifischer pDC Oberflächenmarker ist erforderlich) negative Selektion ist aber über die positive Selektion bevorzugt, als Zellen frei von Antikörper bleiben nach der Auswahl. Isolated pDCs laufen schnelle Apoptose in Kultur. Für Experimente, die diese Zellen benötigen für längere Zeit kultiviert werden können Kulturmedien, die mit IL-3 ergänzt werden. Dieses Zytokin induziert pDC Proliferation und hemmt deren Apoptose 16. Streng kontrolliert werden muss jedoch IL-3 Nutzung, da es zu pDC Reifung oder Differenzierung führen.Die hier beschriebene Methode kombiniert Ziel HIV-1-infizierten Zellen mit frisch isolierten PBMCs oder pDCs, um die ersten Schritte bei der angeborenen Erkundung beteiligt neu zu erstellen. Diese Methode wird zweifellos sinnvoll, explor seine frühen angeborenen Immun Veranstaltungen mit HIV-Infektion assoziiert. Obwohl die damit verbundenen Protokolle werden am Mess Typ-I-IFN richtet, könnten sie leicht modifiziert werden, um andere bioaktive Moleküle aus pDCs bei Erkennung von infizierten Zellen freigesetzt zu messen. Diese können umfassen: Typ-III-IFN (IFN-λ), pro-inflammatorischen Zytokinen (wie TNF-α und IL-6) und der Chemokine CXCL10 CCL4 und CCL5 17.
Wir danken E. Massicotte und J. Herrn für kompetente technische Unterstützung während der Durchflusszytometrie und Zellsortierung Experimenten. Außerdem möchten wir Ihnen für die Bereitstellung von Blutproben danke dem IRCM Klinikpersonal und allen Spendern. Periphere Blutproben wurden von gesunden erwachsenen Spendern, die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki im Rahmen der Forschungsprotokolle von der Forschungsethik Review Board des Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM) genehmigte schriftliche Einverständniserklärung gaben erhalten. Die folgenden Reagenzien wurden durch die NIH AIDS Reagent-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH erhalten: MT4-Zellen von Dr. Douglas Richman; und Menschen rIL-2 von Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Dr. Cohen ist der Empfänger des Canada Research Chair in Menschen Retrovirology. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus CIHR (CIHR 111.226) um Dr. Cohen und aus dem Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS-Netzwerk, um Dr. Bego und Dr. Cohen unterstützt.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |