Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4⁺ T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em> Ex vivo</em> Co-cultuur systeem.

Algemene opmerkingen Het is belangrijk om in kweek te houden zonder antibiotica, omdat zelfs gecontroleerd bacteriële infecties kunnen worden waargenomen door PBMCs. Dergelijke detectie van bacteriële componenten achtergrond interferon productie die niet kunnen worden onderscheiden van die veroorzaakt door HIV-1 specifieke detectie induceren. Verder zijn alle cellen moeten regelmatig worden getest op de afwezigheid van mycoplasma verontreiniging. Gebruik altijd endotoxinevrij oplossingen waar mogelijk. Flow cytometrische karakterisatie van de verschillende cellen voor gebruik in de co-kweken (PBMCs, pDCs, MT4 en CD4 + T-cellen) stap is optioneel, maar sterk aanbevolen omdat het waardevolle informatie die nodig is voor juiste interpretatie van een bepaald experiment kan verschaffen. 1. Bereiding van geïnfecteerde doelcellen Onderhouden humane CD4 + T-cellijn MT4 in RPMI 1640 medieen gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum (FBS), voortaan aangeduid als RPMI-1640 compleet medium. Isolatie van primaire CD4 + T-cellen. Isoleer mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Isoleer CD4 + T-lymfocyten met een CD4 + T-cellen negatieve selectie kit, na aanbevelingen van de fabrikant. Activeren CD4 + T-lymfocyten met PHA-L (5 ug / ml) gedurende 48 uur en vervolgens handhaven cellen in RPMI 1640 compleet-medium aangevuld met recombinant IL-2 (100 U / ml). Infecteren primaire T-cellen 5 dagen na isolatie. Infectie van doelcellen (MT4 T cellijn of heteroloog primaire CD4 + T-cellen). Twee dagen vóór de co-cultuur, infecteren T-cellen met HIV-1 virus. In het specifieke voorbeeld hier beschreven pNL4.3-GFP_ires_Nef wild-type (WT) of pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virussen werden gebruikt. Deze virale stammen vertegenwoordigen green fluorescerend eiwit (GFP) -markering isogene besmettelijke moleculaire klonen die alleen verschillen in hun vermogen om Vpu uiten. Gebruik verschillende multipliciteiten van infectie (MOI) en selecteer culturen met vergelijkbare niveaus van besmetting voor co-culturen. De dag van de co-cultuur bepaalt het percentage GFP + cellen door flowcytometrie als marker van infectie. Gebruik alleen kweken met een bereik van 20-50% geïnfecteerde cellen voor co-kweken. Optionele stappen: Voer flowcytometrische kleuring op dit punt aan de oppervlakte expressie van moleculen / liganden van belang, zoals BST2 en CD4 te evalueren. Voor celoppervlak kleuring, resuspendeer 0,5 x 10 6 T-cellen in 100 pi wasoplossing, voeg 1 pl anti-CD4_PerCP / Cy5.5 en 1 pl anti-BST2_A660. Incubeer buizen gedurende 45 minuten bij 4 ° C vóór wassen met flowcytometrie wasoplossing. Als de onderzoeken zijn gericht op het evalueren van de rol van Vpu gemedieerde BST2 antagonisme, het uitvoeren van een HIV-1 deeltjeafgifte assay op dit moment als hiervoor beschreven 15. 2. Isolatie en Verrijking van Sensing Cells (Whole PBMCs of verrijkte pDCs) Opmerking: Wanneer PBMC's worden gebruikt voor de detectie, starten isolatie binnen een half uur na de bloedafname en het gedrag in een tijdige wijze. Gebruik PBMCs onmiddellijk voor co-culturen of pDC verrijking. Isoleer mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Optionele stap: Voer meerdere parametrische flowcytometrie kleuring te bevestigen dat vers geïsoleerde PBMC bevatten verschillende cellijnen bij fysiologische verhoudingen. Voor celoppervlak kleuring, resuspendeer 10 6 PBMC in 100 pl Fc blokkerende oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Na blokkering voeg 1 pl anti-CD3_Pacific Blue (voor T-cellen), 1 pl anti-CD14-PE_Texas Red (voor myeloïde cellen), 4 pl anti-BDCA2_APC en 1 pl anti-ILT7_PE (voor pDCs). Broedenbuizen gedurende 45 minuten bij 4 ° C vóór wassen met flowcytometrie wasoplossing. Verrijk pDCs met een PDC negatieve selectie kit, na aanbevelingen van de fabrikant. Het wordt aanbevolen om snel te werken, houden de cellen koud, en het gebruik van pre-gekoelde oplossingen. Dit voorkomt dat de aftopping van antilichamen op het celoppervlak en de niet-specifieke cel etikettering, alsmede het waarborgen van maximale pDC activiteit. Het uitvoeren van multi-parametrische flowcytometrische analyse van de vers geïsoleerde pDCs naar zuiverheid, het percentage van de verrijking, en de relatieve hoeveelheden van Pdc- specifieke oppervlakte merkers (zoals ILT7 en BDCA2) bevestigen. Voor celoppervlak kleuring, resuspendeer 10 4 pDCs in 100 pl Fc blokkeren oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Na blokkering voeg 1 pl anti-CD3_Pacific Blue, 1 pl anti-CD14_PE_Texas Red, 4 pl anti-BDCA2_APC en 1 pl anti-ILT7_PE. Incubeer buizen gedurende 45 minuten bij 4 ° C vóór wassen met flowcytometrie wasoplossing (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Ten minste 40% pDC zuiverheid aanbevolen (indien het uitgangsmateriaal 0,4% pDC, zou dit overeenkomt met een 100-voudige verrijking). 3. Co-cultuur van geïnfecteerde CD4 + T-cellen en Sensing Cells (Whole PBMCs of verrijkte pDCs) Meng 220 pl PBMCs (verdund tot 850.000 cellen / ml) of 220 pl pDCs (in een concentratie variërend van 100.000 tot 500.000 cellen / ml) met 30 ul van geïnfecteerde T-cellen (verdund tot 10 6 cellen / ml) per putje in een U-bodem 96 wells plaat. Als controles, plaat PBMCs of pDCs en T-cellen alleen. Stel het volume in goed tot 250 ul met RPMI 1640 compleet medium. Beoordelen van cellulaire reacties op bekende agonist van de TLR7 en TLR9 pathways. Daartoe plaat 220 gl PBMCs (verdund tot 850.000 cellen / ml) of 200 pl pDCs (in een concentratie variërend van 100.000 tot 500.000 cellen / ml) per putje in een U-bodem 96 wells plaat en voeg TLR7 agonist ( Imiquimod, eindconcentratie: 2,5 ug / ml) of TLR9 agonist (ODN 2216 CpG-A, eindconcentratie 5 uM). Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 18-22 uur en verwerken op een wijze vergelijkbaar met de co-kweken hieronder beschreven. Incubeer co-kweken bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 18-22 uur, en vervolgens overbrengen naar een V-bodem 96 wells plaat. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g. Transfer supernatanten een vlakke bodem 96 wells plaat. Supernatanten kunnen bij -80 ° C worden opgeslagen of gebruikt worden voor het type-I IFN detectie onmiddellijk. Resuspendeer co-gekweekte cellen in 2% paraformaldehyde en analyseren met flowcytometrie. Vanwege de verschillen in omvang en granulatie, MT4 cellen zijn gemakkelijk te onderscheiden van PBMCs of pDCs op basis van hun kant-verstrooiing (SS) versus forward-verstrooiing (FS) profielen. Als primaire T-cellen worden gebruikt als doelwit geïnfecteerde cellen, kunnen deze worden gekleurd met een cel tracker kleurstof, zoals CDVU voorafgaand aan co-kweek. Meting van bioactieve type I IFN behulp HEK-Blue IFN-α / β reporter cellen. Opmerking: Deze cellen werden gegenereerd door stabiele transfectie van HEK293-cellen met humane STAT2 en IRF9 genen volledig actieve type I IFN signaalweg verkrijgen. Ze bevatten ook het uitgescheiden alkaline fosfatase (SEAP) reportergen onder controle van de IFN-α / p induceerbare promoter ISG54. Stimulatie van deze cellen met type I-IFN activeert de JAK / STAT / ISGF3 pathway en induceert de productie van SEAP. Handhaaf HEK-Blue IFN-α / β-cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS. Plaat ze bij een dichtheid van 50.000 cellen per putje in een platte-bodem 96 wells plaat in een eindvolume van 180 pl. Voeg 20 ul van co-kweek supernatant aan elk putje in duplo. Elke plaat vereist ook een aantal interne standaard controles (humane IFNa, eindconcentratie van 100 U / ml tot 2500 U / ml). Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 18-22 Hr. Bepaal niveaus van alkalisch fosfatase activiteit met QUANTI Blue-oplossing, die verandert van roze tot paars / blauw in aanwezigheid van het enzym. Bereid QUANTI-Blue volgende aanbevelingen van de fabrikant. Voeg 180 ul van deze oplossing aan elk putje van een vlakke bodem 96-well plaat. Aan elk putje ook toevoegen 20 ui van de geïnduceerde HEK-Blue IFN-α / β cellen supernatanten en incubeer de plaat in een 37 ° C incubator tot kleurontwikkeling in de standaard IFN controleputjes. Evalueer niveaus van SEAP gebruik van een spectrofotometer bij 620-655 nm en het gehalte van het type I-IFN door extrapolatie van het lineaire deel van de standaardcurve IFN.