의 정렬<em> 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여> 셀 펠렛
Summary
액체 성장 스트렙토 배양 크기 이질적인 균사체 펠렛을 특징으로한다. 우리는 여기에서 분석하는 방법을 서술하고 높은 처리량의 방식으로 정렬 펠릿. 이러한 펠릿을 성장 이질성을 이해하고 제어하는 단서를 제공 할 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다.
Abstract
Streptomycetes 효소 및 항생 물질의 생산을위한 산업에서 사용되는 필라멘트 토양 박테리아이다. 생물 반응기에서 재배 할 경우,이 생명체의 크기는 이질적인 펠릿으로 알려진 상호 균사의 네트워크를 형성한다. 여기에 우리가 분석하는 방법을 설명하고 종류 균사체 펠렛은 복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기 (COPAS)를 사용하여. 자세한 설명은 기기와 데이터의 통계적 분석의 기본적인 사용을 나타낸다. 우리는 또한 이러한 RNA 또는 단백질 함량의 분석과 같은 다운 스트림 처리를 가능하게하는 사용자 정의 설정에 따라 펠릿을 정렬 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여 기계 장치 기본 이종 성장에 태클을 할 수 있습니다. 이것은 생산성 펠릿의 크기와 관련이 있다는 사실을 고려하여, 세포 공장으로 streptomycetes 향상을위한 수단이 될 것입니다.
Introduction
Streptomycetes는 사상 토양 아니라 항생제를 만들기 위해 자신의 능력에 대해 알려진 박테리아뿐만 아니라 면역 억제제 나 곰팡이 감염이나 암 1,2을 방지하는 데 사용할 수있는 화합물이다. 또한, 이러한 유기체는 산업 애플리케이션 (3)의 넓은 범위에 대해 관심있는 효소를 생산한다. 이러한 상업적으로 흥미로운 화합물의 대부분은 생물 반응기에서 생산됩니다. 생물 반응기에서 streptomycetes의 성장은 대단히 짧은 시간 또는 펠렛으로 알려진 상호 균사의 복잡한 구조의 형성이 특징입니다. 이러한 다세포 구조는 사이즈 4에 대한 매우 이질적인 및 대장균 또는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 등의 단세포 박테리아보다보다 백만 배 더 큰 크기에 도달 할 수 있습니다. 이성이 자연적인 생물학적 시스템 5에 유리한 특성으로 간주되지만, 그것은 산업의 생산 함정으로 간주됩니다. 바이오원자로 cultivations가 가장 높은 수율을 얻을 재현하고 제어해야합니다. 생물 반응기에서 펠렛 형태의 각각의 역할의 상세한 이해는 세포 공장 등 streptomycetes을 향상시키는 것이 중요하다.
유동 세포 계측법은 일반적 인구 6에서 개별 세포를 분석하는데 사용된다. 유동 세포 계측기를 동시에 (같은 크기, 밀도 및 다색 형광 등) 세포의 특성을 측정함으로써 multiparametric 정보를 취득 할 수있다. 이러한 방법으로, 세포의 특성을함으로써 우리의 문화 내에서 이질성의 이해와 셀 6의 독특한 집단의 존재에 기여 상관 관계 될 수있다. 보다 전문적인 장비는 사용자 정의 매개 변수에 따라 가능한 세포를 정렬 할 수 만들었습니다. 예를 들어, 돌연변이 검사를 할 수 있습니다. 정렬 후, 이러한 돌연변이 세포가 더 특성화 재배 할 수 있습니다. 이것은 이미 다른 사람의 사이에, 유용한 것으로 입증되었습니다,변종 7,8의 생산성을 향상시킬 수 있습니다. 유동 세포 계측기의 노즐은 일반적으로 약 10 ㎛의 최대 직경이 세포의 통과를 위해 수 있습니다. 따라서 streptomycetes의 펠릿을 일정한 유동 세포 계측기로 분석 될 수 없다. 그러나 이들은 복합 오브젝트 파라미터 분석기 및 분류기 (COPAS)으로 분석 할 수있다. 일정한 흐름 세포 계측기와 마찬가지로 COPAS는 높은 처리량 방식으로 입자의 multiparametric 데이터를 수집 할 수 있습니다. COPAS의 유형에 따라 10-1,500 μm의 입자 크기를 분석 할 수있다. 또, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질의 분리 등의 재배 또는 하류 분석에 사용될 수있는 개별 입자의 선별을 허용한다. COPAS은 초기에 선충 예쁜 꼬마 선충 (9), Drosophila의 배아 및 유충 (10) 작은 다세포 생물의 분석 및 정렬을 위해 설계되었습니다. 악기는 제브라 피쉬 (11)에 사용 된차 사상균 (12, 13)에 대한. 후자의 생물은 사상 박테리아에 의해 형성된 그보다 더 큰 균사체 펠렛을 형성한다. 우리는 최근에 COPAS의 사용도 streptomycetes 4 가능한 것을 증명하고있다. 우리는 여기에 크기에 따라 알약을 정렬하는 방법에 대한 세부 사항을 포함하여, 스트렙토 coelicolor의 펠릿 이질성을 평가하기 위해 COPAS를 사용하기위한 실험 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 펠릿 형성 streptomycetes의 분석에 이용 될 수 있다는 점에 유의하시기 바랍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
클론 인구 6 이질성에 대한 우리의 이해에 기여 단일 세포의 많은 수의 고속 분석을 가능하게했습니다 유동 세포 계측법. 일반 유동 세포 계측법은 streptomycetes 및 곰팡이의 균사 다세포 펠릿의 분석에 적합하지 않습니다. 우리의 작업은 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 높은 처리량 분석 COPAS를 사용 가능한 것을 보여 주었다. 여기에 설명하는 절차는 간단하고, 빠르고, 높은 재현성이다. 기기의 동작시주의해야 할 중요한 매개 변수 (스텝이 프로토콜 3.8) 100 이벤트 / 초를 초과하지 않아야 흐름 속도입니다. 펠릿 농도, 따라서 또한 유속이 너무 높게되면 기기가 개별 펠렛을 감지하지 못하기 때문에, TOF 값이 잘못 계산 될 것이다. 충분히 PBS를 첨가하여 시료를 희석하면이 문제를 극복한다.
제한
COPAS 플러스 사용 D 여기에 30-700 μm의에 이르기까지 크기로 입자를 측정하기에 적합하다 1mm의 노즐의 직경을 갖는다. 이 노즐은 따라서 streptomycetes에 의해 형성된 펠릿을 측정 할 수 있습니다. 사상균의 경우 마이크로 콜로니 COPAS 플러스의 일반적인 적용 가능성을 제한하는, 더 클 수있다. COPAS XL 크기는 1,500 μm의 최대 입자를 측정 할 수 있지만 직경의 낮은 범위의 감도는 COPAS 플러스에 비해 적습니다. COPAS 플러스 및 COPAS XL 모두 30 μm의보다 작은 입자를 분석 할 수 없습니다. 이것은 개별 미생물 포자 또는 세포를 분석 할 수 없다는 것을 의미한다. 또한, COPAS 정확하게 포자 세포 또는 아주 작은 마이크로 식민지의 작은 집계를 분석 할 수 있습니다. 이 경우, 정규 셀 분석기가 사용되어야한다. 이 제한은 1-1,500 μm의 범위에서 입자를 분석 할 수있는 연합 Biometrica의 Biosorter에 의해 극복된다. 구매 상품 그러나 높다.
COPAS는 조작하기 쉬운 강력한 도구이다. 그러나, 때로는 펠렛 샘플 컵에 샘플을로드하고 측정을 시작하면 검색되지 않습니다. 원인은 일반적으로 쉽게 '깨끗한'명령을 가압에 의해 해결 될 수있는 항목이 막힌 관이다. 이것은 샘플 컵에 다시 튜브 시스템에서 펠릿을 강제 할 것이다. 다른 이유는 뚜껑이 제대로 샘플 컵에 배치되지 않도록 할 수 있습니다. 이것은 압력 손실 및 펠렛을 검출 수반 장애에 이르게한다.
의의 및 향후 방향
우리는 여기에서 펠릿 크기의 분석에 초점을 맞추고 있지만, COPAS 설정도 분석 할 수와 종류의 형광 및 밀도에 기반하고 있습니다. 형광 검출은 GFP로 기자를 기반으로 유전자 발현을 분석하는 가능하게한다. 또한, 세포의 조성물을 평가할 수있다. 더욱 강력한 이러한 매개에 따라 알약을 분리하는 옵션입니다TERS. 정렬 펠릿은 모든 오 믹스 연구 등의 다운 스트림 분석, 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 이전에 60,000 대와 20 만 작은 알약을 정렬하고 프로테옴 크고 작은 펠릿 4 사이에 유의 한 차이 것을 보여 주었다. 이 기술은 따라서 세포 공장으로 streptomycetes을 개선하기 위해 새로운 단서를 제공한다.
COPAS 기술의 주요 장점은 시간입니다. 세포 펠렛에 대한 이전의 연구는 현미경을 사용하여 수행하고, 이것은 수백 16 개까지 분석 할 수있는 펠릿의 수를 제한 하였다. 현미경 연구는 이미 액체 성장 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 문화 (16)의 펠릿의 두 집단의 존재를 제안했다. 실제로, 펠렛이 집단은 상이한 streptomycetes 4의 다수에 관계없이 배양 조건의 검출 하였다. 이 크기 이질성은 사상균 streptomycetes에 한정되지 않고, 또한 사상균 12에서 관찰되었다 </ SUP>. 모든 경우에, 이성의 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 알약을 정렬 할 가능성이 크기와 형광에 따라 이러한 메커니즘을 해명하는 가능하게한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
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