Ordinamento dei<em> Streptomyces</em> Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter
Summary
Colture Streptomyces liquidi coltivati sono caratterizzati da pellet miceliali che sono eterogenei in termini di dimensioni. Siamo qui descrive un metodo per analizzare e ordinare tali pellets in maniera high-throughput. Questi pellet possono essere utilizzati per ulteriori analisi, che fornirà porta a comprendere e controllare la crescita eterogeneità.
Abstract
Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che vengono utilizzati nell'industria per la produzione di enzimi e antibiotici. Quando coltivate in bioreattori, questi organismi formano reti di ife interconnesso, noto come pellet, che sono varie per dimensione. Qui si descrive un metodo per analizzare e pellets ordinamento miceliali utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter (COPAS). Istruzioni dettagliate sono presenti per l'uso dello strumento e l'analisi statistica dei dati di base. Abbiamo, inoltre, descrive come pellet possono essere ordinati in base alle impostazioni definite dall'utente, che permette l'elaborazione a valle, come l'analisi del RNA o contenuto proteico. Utilizzando questa metodologia il meccanismo di base la crescita eterogenea può essere affrontato. Ciò sarà determinante per migliorare streptomycetes come una fabbrica di cellule, considerando il fatto che la produttività correla con dimensioni pellet.
Introduction
Streptomycetes sono batteri filamentosi suolo che sono ben noti per la loro abilità a rendere antibiotici, nonché composti che possono essere usati come immunosoppressori o per combattere le infezioni fungine o 1,2 cancro. Inoltre, questi organismi producono enzimi che sono di interesse per una vasta gamma di applicazioni industriali 3. La maggior parte di questi composti commercialmente interessanti sono prodotte in bioreattori. Crescita di streptomycetes in bioreattori è caratterizzata dalla formazione di strutture complesse di ife interconnesso, noti come grumi o pellet. Queste strutture multicellulari sono molto eterogenei rispetto alle dimensioni 4 e possono raggiungere dimensioni che sono più di un milione di volte più grande di un batterio unicellulare come Escherichia coli o Bacillus subtilis. Sebbene eterogeneità è considerato come un tratto utile in sistemi biologici naturali 5, è considerato un trabocchetto produzione nel settore. Biocoltivazioni reattori devono essere riproducibile e controllabile per ottenere i massimi rendimenti possibili. Una comprensione dettagliata del ruolo di ciascuno dei tipi di pellet in un bioreattore è quindi fondamentale migliorare streptomycetes come fabbriche.
La citometria a flusso è comunemente usato per analizzare le singole celle di una popolazione 6. Citofluorimetri possono acquisire informazioni multiparametrica simultaneamente caratteristiche delle cellule (come le dimensioni, la densità e multicolore fluorescenza) di misura. In questo modo, le proprietà della cella possono essere correlati contribuendo in tal modo alla nostra comprensione di eterogeneità all'interno di una cultura e l'esistenza di distinte popolazioni di cellule 6. Strumenti più specializzati hanno reso possibile ordinare le celle in base a parametri definiti dall'utente. Per esempio, i mutanti possono essere sottoposti a screening. A seguito di ordinamento, tali cellule mutanti possono essere coltivati per un'ulteriore caratterizzazione. Questo ha già dimostrato di essere utile, tra l'altro,per migliorare la produttività dei ceppi 7,8. Gli ugelli di citofluorimetri tipicamente consentono il passaggio di cellule con un diametro massimo di circa 10 micron. Pertanto, pellets di streptomycetes non possono essere analizzati con citofluorimetri regolari. Essi, tuttavia, possono essere analizzati con l'oggetto complesso Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Come citofluorimetri regolari, COPAS può acquisire i dati multiparametrici di particelle in un alto modo di throughput. A seconda del tipo di COPAS 10-1,500 micron particelle di dimensioni possono essere analizzati. Inoltre, permette di classificare delle singole particelle che possono essere usati per la coltivazione o analisi a valle, come l'isolamento di DNA, RNA, o proteine. COPAS è stato inizialmente progettato per l'analisi e la cernita di piccoli organismi pluricellulari, come il nematode Caenorhabditis elegans 9, e degli embrioni di Drosophila e larve 10. Gli strumenti sono stati utilizzati anche per zebrafish 11 bisnd per funghi filamentosi 12,13. Questi ultimi organismi formano anche pellets miceliali che sono anche più grandi di quelle formate da batteri filamentosi. Abbiamo recentemente dimostrato che l'uso di COPAS è anche fattibile per streptomycetes 4. Siamo qui descriviamo la procedura sperimentale per l'utilizzo dei COPAS per valutare pellet eterogeneità Streptomyces coelicolor, compresi i dettagli sulla metodologia per ordinare pellet in base alle dimensioni. Si prega di notare, tuttavia, che questo metodo può essere utilizzato anche per l'analisi di altri streptomycetes-pellet formatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citometria a flusso ha permesso l'analisi ad alta velocità di un gran numero di singole cellule, che ha contribuito alla nostra comprensione di eterogeneità nelle popolazioni clonali 6. Citometria a flusso regolare non è fattibile per l'analisi del pellet miceliali pluricellulari di streptomycetes e funghi. Il nostro lavoro ha dimostrato che l'analisi high-throughput del pellet Streptomyces è fattibile utilizzando COPAS. La procedura descritta qui è semplice, veloce e altamente riproducibile. Il parametro fondamentale tenere a mente durante il funzionamento dello strumento è la velocità di flusso, che non deve superare i 100 eventi / sec (passo 3.8 del presente protocollo). Se la concentrazione pellet, e quindi anche la velocità del flusso, diventa troppo elevata, i valori TOF vengono calcolati correttamente, poiché lo strumento non rileva singoli pellet. Sufficientemente diluizione del campione con l'aggiunta di PBS supera questo problema.
Limitazioni
L'uso COPAS più d qui ha un diametro dell'ugello di 1 mm, che è adatto per misurare particelle con una dimensione che vanno 30-700 micron. Questo ugello consente pertanto pellets formate da streptomycetes misurazione. Nel caso dei funghi filamentosi micro-colonie possono essere più grandi, che limita l'applicabilità generale del COPAS Plus.. Il COPAS XL può misurare particelle fino a 1.500 micron di dimensione ma la sua sensibilità nella gamma inferiore di diametro è inferiore rispetto a quella del COPAS Plus.. Sia il COPAS Plus e il COPAS XL non è in grado di analizzare le particelle di dimensioni inferiori a 30 micron. Ciò implica che le singole spore microbiche o cellule non possono essere analizzati. Inoltre, il COPAS non può analizzare con precisione piccoli aggregati di spore e cellule o le piccolissime micro-colonie. Per questo, devono essere utilizzati analizzatori di cellule normali. Questa limitazione viene superata dalla Biosorter di Union Biometrica capace di analizzare particelle nell'intervallo 1-1,500 micron. Il premio acquisto è comunque alto.
Il COPAS è uno strumento robusto che è facile da usare. Tuttavia, a volte pellet non vengono rilevate dopo il caricamento di un campione nella tazza campione e iniziare la misurazione. La causa è in genere un tubo di entrata intasato, che può essere facilmente risolto premendo il comando 'pulito'. Questo forzerà il pellet indietro dal sistema di tubi nella tazza campione. Un motivo in alternativa potrebbe essere che il coperchio non è posizionato correttamente sulla tazza del campione. Questo porta alla perdita di pressione e la mancata concomitante per rilevare pellets.
Significato e direzioni future
Abbiamo qui concentrati sull'analisi della dimensione pellet ma l'installazione COPAS è anche in grado di analizzare e liste basato su fluorescenza e densità. Rivelazione della fluorescenza consente di analizzare l'espressione genica basato su reporter come GFP. Inoltre, la composizione di cellule può essere valutata. Ancora più potente è la possibilità di separare pellets in base a questi parametriTERS. Pellets ordine possono essere utilizzati per le analisi a valle, compresi tutti-omiche studi. Infatti, abbiamo già risolto 60.000 grandi e 200.000 piccole palline, e dimostrato che il proteoma era significativamente differente tra grandi e piccole palline 4. Questa tecnologia fornisce dunque nuovi contatti per migliorare streptomycetes come fabbriche di cellule.
Il vantaggio principale della tecnologia COPAS è il tempo. Precedenti studi sulla pellet cellulari sono stati eseguiti utilizzando la microscopia, e questo limita il numero di pellet che possono essere analizzati fino a diverse centinaia 16. Studi di microscopia già suggerito l'esistenza di due popolazioni di pellets in Streptomyces colture liquide cresciuto 16. Infatti, due popolazioni di pellet sono stati rilevati, indipendentemente dalle condizioni di coltura in un gran numero di differenti streptomycetes 4. Questa eterogeneità dimensione non è limitata a streptomycetes filamentosi, ma è stata osservata anche in funghi filamentosi 12 </ Sup>. In tutti i casi, i meccanismi alla base della eterogeneità non sono ancora noti. La possibilità di ordinare pellet in base alle dimensioni e fluorescenza ci permette di svelare tali meccanismi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
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