光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

1。細胞培養無菌培養チューブとピペットチップを使用してください。 E.大腸菌株 AB1157 のpolA-PAmCherryは POL 1のC末端PAmCherry融合を運ぶ。融合は、Datsenko らに記載のようにラムダ-レッド組換えを用いて野生型遺伝子を置換することにより天然の染色体位置に挿入した。DNA損傷剤メチルに対する細胞増殖速度および感度によって判断されるように、融合タンパク質の8の機能を確認したメタンスルホネート（MMS）。細胞株の構築についての詳細はUphoff らに記載されています。7、Datsenkoら 8、および レイエス-ラモスら 9細胞培養物の自己蛍光を低減し、顕微鏡スライド上のバックグラウンド粒子を避けるために、M9最少培地で増殖させる。あるいは、栄養豊富な定義された培地を、10を用いることができる。 ストリークE.大腸菌菌株AB1157選択的抗生物質（ここでは、25μg/ mlのカナマイシン）とルリアブロス（LB）アガロースプレート上の凍結グリセロールストックからのpolA-PAmCherryとは、37℃で一晩インキュベートする。 単一細胞コロニーから5ミリリットルのLB培地に接種し、3時間220 rpmで振盪37℃で成長する。 5ミリリットル中に培養1:10,000に希釈する最少培地（M9培地、MEMアミノ酸がプロリン+、MEMビタミン、0.2％グリセロール）と37℃で一晩220rpmで振とうでインキュベートする。 翌朝、分光光度計を用いて光学濃度（OD）を測定し、OD 0.025に5ミリリットル新鮮な最小培地を文化を希釈する。初期の指数期（OD 0.1）に220 rpmで振盪37℃で2時間、成長する。 5分間2300×gで遠心分離することによって1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の細胞の1ミリリットルを集中。上清を除去し、20μlの残留培地および渦に細胞ペレットを再懸濁します。 2。顕微鏡スライドPreparatイオンのdH 2 Oを1.5％の低蛍光アガロース溶液を調製溶液が透明になるまで、アガロースを溶融するために電子レンジを使用しています。穏やかにピペッティングして、数回上下2X最小培地500μlで、溶融したアガロース溶液500μlを混合します。 顕微鏡カバースリップ（ノー1.5厚さ）の中央に均等にアガロース溶液を広げた。これは、アガロースが冷却する前に気泡を避け、迅速に行わなければならない。 第二のカバーガラス（ノー1.5厚さ）でパッドを平ら。バックグラウンドの蛍光体粒子を除去するために、カバースリップは、以前は1時間500℃の炉内で燃焼した。焼かカバースリップをアルミ箔で覆われ、室温で数週間保存することができる。 DNA損傷実験のために、100 mMのMMSを含むアガロースパッドを準備します。ステップ2.1から2.3の手順に従いますが、100 mMのMの最終濃度、溶融された1.5％アガロースを500μlと混合する前にM9培地500μlに8.3μlのMMSを追加MS。 （ 注意！MMSは毒性と変異原性であり、手袋、マスク、ゴーグル、そして白衣を処理する必要があります）。 パッドから一番上のスライドを削除し、パッド上に濃縮した細胞懸濁液の1を添加する。未使用焼かカバースリップ（ノー1.5厚さ、顕微鏡対物指定に一致）でパッドを覆うことにより、スライド上で、非常に軽く押して、細胞を固定。細胞は、アガロースパッドが乾燥する前に、固定化の45分以内に画像化されるべきである。長い実験中に乾燥を防ぐために、アガロースパッドは、シリコンガスケットを用いて封止することができる。 DNA損傷実験のために、撮像の前に室温で加湿された容器内で20分間、100mMのMMSを含有するアガロースのパッド上に固定化された細胞をインキュベートする。 3。顕微鏡データ収集の準備 Palmは検出と単一の蛍光タンパク質の正確な位置に依存しています。感度との最適なアラインメント顕微鏡は、データ品質のために重要である。単一分子蛍光顕微鏡は、典型的には、カバーガラス表面上の薄い部分内のみフルオロフォアを励起することによって信号対雑音比を高めるために全内部反射（TIR）照明を採用する。ここでは、E.内部イメージング大腸菌は非常にわずかに励起光の角度を減少させることによって、TIRF顕微鏡で達成することができる傾斜照明11を必要とする。 PAmCherryイメージングは​​さらに、405 nmの光活性化レーザーおよび561 nmの励起レーザーを必要とする。蛍光発光は、114.5ナノメートル/ピクセルのピクセル長さが得られる倍率でCCD（EMCCD）カメラの電子増倍に記録される。最適なローカリゼーション精度のために、画素サイズは約あまりにも多くのピクセル上に信号を拡散することなく、十分なサンプリングを確保するために、PSFの標準偏差の幅と一致している必要があります。 図3は、最小限のPALMセットアップの模式図を示す。 動画1特注の顕微鏡構築プロセスの印象を与える;楽器の詳細については、Uphoff ら 7を参照してください。 ルーチン顕微鏡合わせを行う。 405 nmおよび目的の前に561 nmの連続波レーザー強度を測定します。 3.5 MW（〜400 W / cm 2）をし、10μW（〜1 W / cm 2）を 405 nmの強度に561 nmの強度を調整します。 0-10μWから405 nmの強度が徐々に調整することができる連続可変NDフィルターホイールを使用してください。実験の開始まで、レーザー照明のスイッチを切る。 顕微鏡ステージ上のサンプルを配置し、透過光顕微鏡モード（ 図4A）で焦点に細胞をもたらす。 EMCCDカメラゲインが白とびして、カメラへの損傷を防止するためにスイッチオフされなければならない。 データサイズを小さくし、カメラの読み出し速度を増加させるためにトリミングさFOVを規定する。 周囲の光とSWITからサンプルをカバーEMCCDカメラゲインにCH。 （0.26ミリカメラの読み出し時間を含む）15.26ミリ秒/フレームにフレームレートを設定します。ディスカッションセクションの「露出時間と励起強度」を参照してください。 暗い背景信号（ 図4B）を確認するためにカメラデータを表示します。 561 nmのレーザーのスイッチを入れ、励起バックグラウンド信号（ 図4C）を確認します。 POL 1-PAmCherry融合タンパク質の光活性化のために405 nmのレーザーのスイッチを入れ、蛍光のPSFが表示されるまで強度を上げる。 カバーガラスの表面に近いサンプルだけ薄い部分を照明するために励起ビームの角度を調整します。 このために、レーザビームは100X 1.4 NA対物レンズの後焦点面（ 図3）に集光される。ビームに対して垂直に焦点レンズを平行移動すると、離れて角度で目標を終了するには、ビームを引き起こす目的の中心からフォーカスを移動します。 人工知能蛍光強度を最大化し、バックグラウンド信号を最小にするmである。厳格なTIR励起がカバースリップ表面の100ナノメートル内の画像蛍光団が最適であることに注意してください、しかし、画像化DNA結合タンパク質を大腸菌に関連付けられている大腸菌核様体は、0.8ミクロンまでの深い照明を必要とします。 4。データ収集ここでは、Palmの映画を取得するための一般的なプロトコルを記述します。同じ手順が損傷を受けていないE.でPOL 1-PAmCherry融合タンパク質を画像化するために適用される大腸菌の細胞およびMMSに連続DNA損傷治療中。セルごとに異なる​​分子量またはコピー数の融合タンパク質に対する法の適用（ディスカッションのセクションを参照）別の取得設定が必要になります。 透過光顕微鏡モードでのセルの新しい視野（FOV）を見つけて、画像の焦点を合わせる。セルの輪郭（ 図4A）を記録するために、カメラのスナップショットを取る。周囲の光からサンプルをカバーし、EMCCDカメラゲインに切り替えます。 561 nmのレーザーのスイッチを入れ、データ収集を開始する前に、数秒間、カバースリップ上の細胞の自家蛍光や背景スポットを漂白。細胞増殖させ、M9培地で画像化し、非常に少ない蛍光バックグラウンドは通常存在したカバーガラスを焼い使用しているが、予備漂白することは、LBなどの豊富な増殖培地中で細胞を画像化に有用である可能性があります。強烈な照明がとても予備漂白細胞に対して毒性であることに注意して最小限に抑える必要があります。 15.26ミリ秒/フレームで連続561 nmの励起下PALMムービーの取得を開始します。 405 nmのレーザーのスイッチを入れ、徐々に、映画の過程で強度を高め、1 W / cm 2の最大に達した。携帯の自家蛍光を引き起こす高い405 nmの強度を避けてください。蛍光分子の密度に注意を払う – それは低い活性化率を維持することが重要であるのPSFが明確になるように各フレーム（ 図4D-F）で単離した。 万フレーム/ムービー（セルごとに画像化される分子の数に応じて）を記録し、1映画は、通常、2〜3分かかり、FOVの大きさに応じてハードディスクの空き容量0.5〜1 GBのが必要です。 複数の視野のための取得手順を繰り返します。 PAmCherryフルオロフォアは、光活性化して不可逆的に漂白付いているので、各FOVは一度だけ撮影することができることに注意してください。 5。データ解析自動化され、堅牢なデータ解析フレームワークは、方法の性能および効率のために必須である。我々は、MATLABで記述されたカスタム·ソフトウェアを使用しています。 14。クロッカーら 12、ホールデンら 13、HoldenI らに記載のアルゴリズムを用いて局在化分析を実行し、ウィーザーら 15のPSFは、第7画素のガウスカーネルを用いたバンドパスフィルタ画像において識別されるの径（ 図5A）。候補位置は、バックグラウンド信号（ 図5B）の4.5倍の標準偏差上記ピーク画素強度とのPSFに対応しています。候補PSFあたりのローカルで最も明るいピクセルが楕円ガウス関数（ 図5C）を装着するための初期推定として機能します。無料のフィットパラメータは次のとおりです。x位置、y位置、X幅、Y幅、回転角度、大きさ、背景のオフセット。楕円形のガウスマスクは、PSFをぼかして変形露光時間中に分子を占めています。 同じFOVの透過光顕微鏡画像上にPALM映画のすべてのフレームからの結果（X、Y）版をプロットします。 POL 1-PAmCherryのローカライズは、Eの中央領域内に表示されます大腸菌細胞 （ 図6A）。多くのローカライズは、細胞の外に表示される場合は、ローカライズのしきい値の設定が低すぎる、またはサンプルは、バックグラウンド蛍光粒子を含んでいた。 自動追跡分析のために、クロッカーらに記載されたアルゴリズムのMATLABの実装がら 12（ディスカッションセクションの「拡散分析」を参照）を使用することができる。ユーザ定義のトラッキング·ウィンドウ内の後続のフレームに表示される位置は、軌道を形成するように接続される。複数のローカライゼーションは、同じウィンドウで発生した場合には、トラックは一意ステップ長の合計を最小化することによって割り当てられる。単一粒子追跡データから拡散係数を算出する際に様々な検討事項の詳細な議論については、ウィーザーら 15を参照このアルゴリズムは、トラックの間に過渡的な点滅または逃したローカライズを考慮して、メモリー·パラメータを使用しています。ここでは、1フレームメモリにパラメータを設定し、より高い値は、長寿命の暗状態でのフルオロフォアを追跡するために使用することができる。 次のキャリブレーションの手順に基づいて、適切なトラッキング·ウィンドウを選択します。 POL 1のために、我々は0.57ミクロン（5ピクセル）を使用します。ウィンドウ·パラメータを追跡する範囲の追跡アルゴリズムを実行します。トラック（ 図6B）を分割していない可能な限り最小のトラッキング·ウィンドウを識別するための追跡窓の関数として、セル毎に測定トラック数を計算します。 細胞内の分子の動きの空間分布を視覚化するために同一のFOVの透過光顕微鏡画像上で得られたトラックをプロットする。 POL 1トラックは、単一の細胞（ 図6C-D）内に閉じ込められた拡散が表示されるはずです。 トラックの一部が細胞間を横切るように見える場合、これはトラッキング·ウィンドウは大きすぎ、および/ ​​または光活性化率は（ 図6E）が高すぎた選ばれたため、別々の分子が誤ってリンクされていたことを示唆している。 連続したローカリゼーション（ 図6F）との間にステップ長の累積分布をプロットします。曲線は上昇し、十分に大きな追跡窓スムーズに飽和ウィンドウが小さすぎて選択された場合しかし、カットオフエッジを示しています。 POL 1の拡散特性を分析するために、N個のステップの合計で各トラックの連続した​​ローカライズ版の間の平均二乗変位（MSD））を計算します。 MSD = 1 /（N-1）Σi = 1から N-1 （X I 1 – X I）2 +（Y I 1 – Y i）を 2。 唯一MSD値の統計的な不確実性を減らすために、少なくとも4段階（N≥5ローカライズ）の付いている曲があります。 複数のフレーム（ 図6G）を介して変位を計算することにより、遅延時間の範囲にわたり、MSD値の曲線をプロットします。 MSDカーブの形状が観察された分子の動き（ 図6H）を分類するのに役立ちます。 MSDからトラックごとの見かけの拡散係数D *を計算します。 D * = MSD /（4ΔT） – LOC 2 /Δtがσ。 第2のTERMは、その定位誤差を補正する（ここでは、LOCσ= 40 nmおよびΔT= 15.26ミリ秒、ウィーザーらを参照してください。15）。 FOV（ 図7A）のすべてのトラックから測定D *値のヒストグラムをプロットします。 トラック毎に測定D *値に基づいて、染色体に結合して表示され、個々のPOL 1分子を同定。バウンドの集団別の（を中心としたシャープな分布をD *〜0程度2 /秒）とD * <0.15ミクロン2 /秒のしきい値を設定することで、自由に拡散する分子（広い分布は、Dを中心とした*〜0.9μmの2 /秒）（ 図7Aおよび7Dに赤いバー）。 損傷を受けていない細胞（ 図7A-C）の中およびMMS（ 図7D-E）でDNA損傷治療の下で細胞内の局在性、追跡、およびPOL 1のための拡散分析を行う。バインドされたトラックの割合は、DNの直接的な定量的な測定を提供生体内で POL 1の修復活性。