JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/51173
, ,
1Department of Entomology,Virginia Tech

Summary

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения организации ядра клетки и эволюции кариотипа. Здесь мы демонстрируем подход к изоляции и усилению определенных областей интереса от одиночных политеных хромосом, которые впоследствии используются для двух- и трехмерной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Abstract

Флуоресцентная гибридизация на месте (FISH) зондов хромосомы целых рук является надежным методом для картирования геномных областей, представляющих интерес, обнаружения хромосомных перестановок и изучения трехмерной (3D) организации хромосом в ядре клетки. Появление микродиссеции захвата лазера (LCM) и усиления всего генома (WGA) позволяет получать большое количество ДНК из одиночных клеток. Повышенная чувствительность комплектов WGA побудила нас разработать хромосомные краски и использовать их для изучения организации хромосом и эволюции в не моделных организмах. Здесь мы представляем простой метод для изоляции и усиления эухроматических сегментов одной политенской хромосомы оружия из яичников клетки медсестры африканского малярийного комара Anopheles gambiae. Эта процедура обеспечивает эффективную платформу для получения хромосомных красок, уменьшая при этом общий риск введения в образец иномаенной ДНК. Использование WGA позволяет несколько раундов повторного усиления, в результате чего большое количество ДНК, которые могут быть использованы для нескольких экспериментов, в том числе 2D и 3D FISH. Мы показали, что разработанные хромосомные краски могут быть успешно использованы для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. В целом, объединение LCM и однофомохм WGA обеспечивает эффективный инструмент для создания значительного количества целевой ДНК для будущих цитогенетических и геномных исследований.

Introduction

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения эволюции кариотипов 1-5 и для визуализации цитогенетических аномалий с помощью гибридизации флуоресцентно помечены хромосомной ДНК 1,6-8. Этот метод также применяется к изучению 3D-динамики хромосомных территорий в развитии 9 и патологии 10. Дифференциально помеченные хромосомные краски используются для визуализации отдельных митотических 11,12, мейотических 13,14или межфазных нелифазных не политен 15,16 и политен 9,11,17 хромосом. Простой и надежный протокол для получения хромосомных красок был бы очень полезен в распространении этого метода на не моделевые организмы, такие как комары. Комплекс Anopheles gambiae – это группа из семи морфологически неразличимых комаров, которые различаются по поведению и адаптации, включая способность передавать малярию.  Эти комары служат отличной моделью, чтобы лучше понять эволюцию тесно связанных видов, которые сильно отличаются по своей векторной способности.  Большинство цитогенетических исследований малярийных комаров были проведены с использованием хорошо развитых, высоко политенизированных хромосом (рассмотрено в 18,19). Читаемые модели полос поликретных хромосом позволили исследователям продемонстрировать связь между полиморфными инверсиями и экологической адаптацией в Anopheles gambiae 20. Кроме того, в комплексе An. macullipennis были охарактеризованы специфические для тканей 21 и видоспецифические 22 особенности 3D-политеной хромосомы. Тем не менее, изучение митотических хромосом может предоставить дополнительную важную информацию. Например, более высокий уровень полиморфизма гетерохроматина, наблюдаемый в митотических хромосомах, коррелирует со снижением брачной активности и фертильности в An. gambiae 23. Переписку между эвхроматическими сегментами политеных и митотических хромосомных рук трудно установить только путем сравнения их относительной длины. Это потому, что хетерохроматин составляет значительную часть митотических хромосом, но недопредставлен в политенные хромосомы 24. Наличие хромосомных красок для малярийных комаров позволит исследователям значительно расширить цитогенетические исследования, включив в нее дополнительные виды, при этом существенно сократив затраты и время при анализе кариотипической эволюции и 3D-динамики хромосом в этой группе эпидемиологиологически важных насекомых.

Для того, чтобы получить большие участки хромосом, микроперемида стала неотъемлемой техникой для манипулирования и изоляции конкретных областей, представляющих интерес для хромосомного дополнения.  В сочетании с усилением всего генома (WGA), микроперемида приводит к мощным приложениям вниз потечению,включая FISH 11,12 и секвенирование генома следующего поколения 25-27. Ранее методика требовала использования специализированных микропересмешования игл, которыми должен был управлять опытный пользователь 28.  Развитие микродиссеции лазерного захвата (LCM) привело к упрощенному инструменту, лучше подходящему для изоляции одиночных клеток 29,30 или отдельных хромосом 31-33 с уменьшенным риском заражения. Такой подход позволяет пользователю изучать генетические неоднородности и хромосомные аномалии, которые происходят в одиночных клетках, вместо консенсусного ландшафта, который является результатом объединения нескольких клеток вместе 34-36. Для усиления ДНК, образоваемой в результате микропересовок, было использовано несколько методов.  DOP-PCR, метод, полезный для усиления высоко повторяющихся последовательностей, был использован для усиления микродиссекции хромосом от видов, включая кузнечика 37, колючий угорь 38, и Нил тилапии 39.  Совсем недавно, PCR основе GenomePlex WGA4 одноклеточный комплект и несколько усиления смещения на основе (MDA) Repli-G одноклеточный комплект стали ценными инструментами для экспериментов, связанных с генетическим анализом одиночныхклеток человека, а также хромосомы 40-42, в том числе B хромосомных систем в кузнечиков 37 и саранчи 43. Эти два комплекта имеют преимущества и недостатки, но их явное превосходство над другими доступными системами усиления было продемонстрировано 44.

Количество ДНК, которое может быть получено из одной хромосомы или хромосомного сегмента, значительно меньше, чем у целого ядра. Поэтому микроперемиск, усиление и последующий анализ одной хромосомы являются гораздо более сложными, особенно в организмах с небольшими геномами, как в Drosophila или Anopheles.  Хотя краски были разработаны из одного микродиссектных хромосом человека 33 и оса 45, успешный эксперимент FISH требует нескольких (по крайней мере 10-15) микродиссектных митотических хромосом плодовой мухи 11. Тем не менее, способность к микродизайзацию и усиление одной хромосомы будет иметь важное значение для i) снижение вероятность загрязнения материалом из другой хромосомы, (ii) минимизации числа хромосомных препаратов, необходимых для микродиссции, (iii) снижение нуклеотида и структурного полиморфизма микродиссекции образца как в FISH, так и в секвенировании вниз по течению. Политене хромосомы, найденные во многих видах диптериан предлагают уникальную возможность приобрести гораздо более высокое исходное количество ДНК. Они также обеспечивают более высокое разрешение и хромосомную структуру, которые не могут быть достигнуты с помощью митотических хромосом. Это добавленное разрешение может иметь решающее значение для визуализации хромосомных перестановок, хроматиновой структуры и хромосомных сегментов, которые будут микродиссектированы 28,46.

Здесь мы представляем процедуру эффективной изоляции эухроматический сегмент от одной политеной хромосомы руки, усилить ДНК, и использовать его в нижнем течении FISH приложений у малярийных комаров.  Во-первых, мы применяем LCM, чтобы изолировать и извлечь одну хромосомную руку из специально подготовленных мембранных слайдов. Во-вторых, WGA используется для усиления ДНК из микродиссектного материала. В-третьих, мы гибридизируем усиленную ДНК в экспериментах FISH для препаратов из политеного сквоша 47,метафазы и межфазной хромосомы слайдов 48,а также 3D образцов яичников. Эта процедура была сделана, чтобы успешно нарисовать большинство евхроматина в хромосомных руках An. gambiae.

Protocol

1) Поликрете хромосомы слайд подготовки для лазерного захвата микроперепись Вскрыть полугравид anopheles женщин на 25 часов после крови кормления. Исправить яичников примерно от пяти женщин до 500 мкл свежего модифицированного раствора Carnoy (100% метанол: ледниковая уксусная кислота, 3:1) при комнатной температуре в течение 24 часов. Передача яичников на -20 градусов по Цельсию для длительного хранения. Приготовьте раствор Carnoy (100% этанола: ледниковая уксусная кислота, 3:1) и 50% пропионовой кислоты непосредственно перед созданием хромосомных слайдов. Поместите одну пару яичников в одну каплю раствора Карноя на слайде ПЭТ-мембраны Зейс 1.0. В зависимости от размера, разделить яичники примерно на 2-4 секции с рассечением игл и поместить их в каплю 50% пропионовой кислоты на чистых слайдах под микроскопом вскрытия. Отдельные фолликулы и удалить оставшиеся ткани с помощью бумажного полотенца под стереомикроскопом вскрытия. Добавьте в фолликулы новую каплю 50% пропионовой кислоты и дайте им посидеть 3-5 минут при комнатной температуре. Поместите силиконовый крышку поверх капли. Пусть слайд стоять около 1 мин. Обложка слайд с абсорбентным материалом (фильтровательная бумага используется для этого метода), и при использовании ластик стороне карандаша, применить щедрое количество давления на крышку, нажав на него неоднократно с ластиком. Нагрейте слайд до 60 градусов по системе денатурации/гибридизации слайдов в течение 15-20 минут, чтобы помочь в выравниванию политеных хромосом. Поместите слайды во влажную камеру при 4 градусах цельсия на ночь, чтобы кислота далее сплющила хромосомы. Поместите горки в холодный 50% этанола в течение 10 мин. Аккуратно снимите крышку и замените в холодном 50% этанол еще на 10 мин. Обезвоживаемые горки в 70%, 90%, 100% этанола в течение 5 минут каждый. Воздушные сухие горки. Подготовь решение буферного решения GURR, добавив одну буферную таблетку к 1 л дистиллированной воды. автоклав. Приготовьте раствор Giemsa, добавив 1 мл раствора окрашивания Giemsa в 50 мл буфера GURR. Поместите высушенные в воздухе горки в раствор Giemsa в течение 10 минут и мыть три раза в 1X PBS. Воздух снова скользит в контролируемом стерильном климате, чтобы избежать загрязнения. 2) Лазер захвата микроперепись одной поликретной хромосомы руку В этом разделе подробно использование программного обеспечения PALMRobo, который поставляется с системой PALM MicroBeam Laser Microdissection. Очистите микроскоп 100% этанолом. Стерилизовать перчатки и трубки с ультрафиолетовым светом в УФ-кросслинкере. Включите лазерный микроскоп PALM MicroBeam и включите лазер. Откройте набор лазерного вскрытия PALMRobo и при необходимости настройте настройки “Power” и “Focus”. Поиск политеной хромосомы руку интереса. Используя инструмент “Pencil”, наметим выбранный регион. Откройте “Окно элементов” из бара меню. Выберите “Drawn элемент”, убедитесь, что вы выбрали “Cut”. Установите клейкую крышку трубки в держатель и место над слайдом, оставляя небольшой разрыв <1 мм в размерах, и начать лазерной резки. Поместите “Выбор катапульты” в разрезе сайта, оставляя пространство между краем и хромосомой. Выберите “LPC” из опции падения вниз и начните катапультироваться. Проверьте, чтобы убедиться, что образец был катапультировался в крышку, нажав на значок “Глаз”. 3) Очистка ДНК из одной микродиссектной политеновой хромосомы руки Следуйте инструкциям микрокита ДНК ЗИАМП для высвобождения и очистки собранной ДНК. Шаг 3.1 был изменен для размещения перевернутой трубки. Добавьте 15 мкл буфера ATL и 10 мкл протеиназы K в перевернутую трубку (внутри крышки) и инкубировать при 56 градусах по Цельсию в течение 3 часов. Добавьте буфер ATL, буфер AL 50 хл и 1 РНК носителя; микс. Добавьте 50 йл 100% EtOH; смешивать. Передача лизайта в колонку ЗИАмп; центрифуга. Вымойте, добавив буфер AW1 500 мкл; центрифуга. Поместите столбец в новую трубку сбора, добавьте буфер AW2 500 йл; центрифуга. Поместите столбец в новую трубку; центрифуга для удаления избыточной жидкости. Поместите столбец в трубку микроцентрифуга 1,5 мкл и добавьте 20 мкл воды в элют; центрифуга. Испарите свежевыбитую ДНК до конечного объема в 9 мкл с помощью вакуумной трубы. 4) Усиление ДНК из одной микродиссектной поликретной хромосомы руки Два различных протокола были использованы для WGA одной хромосомной руки. Усиление ДНК и подготовка зонда через GenomePlex WGA Следуйте протоколу GenomePlex Single Cell WGA4 Kit для получения первой партии усиленной ДНК: Добавьте свежеприготовленный раствор Proteinase K в образец 9 мкл; смешать. Инкубировать ДНК при температуре 50 градусов по Цельсию в течение 1 часа, затем нагреть до 99 градусов по Цельсию в течение 4 минут. Держись на льду. Добавить 2 х 1X одноклеточной библиотеки Подготовка буфера и 1 мкл решения стабилизации библиотеки; mix. Нагрейте образец до 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин. Охладить на льду и центрифуге. Добавить 1 мл фермента подготовки библиотеки; смесь и центрифугу. Инкубация следующим образом: Добавьте 7,5 мкл 10X усиления Master Mix, 48,5 мл воды. 5.0 йл ДНК полимеразы WGA; смесь и центрифугу. Термоцикл следующим образом: Очистите ДНК с помощью геномной ДНК Чистый и концентратор kit. Протокол таков: Добавьте 5:1 буфер связывания ДНК: образец ДНК (специально для геномной ДНК менее 2 кб. Если ДНК образца больше 2 кб, используйте соотношение 2:1) и перенесите в предоставленный спин-колонку. центрифуга. Добавьте 200 йл ДНК Уош Буфер и центрифугу. Повторите шаг мытья. Затем добавьте 50 мкл воды и утейте ДНК в новую трубку 1,5 мл. Повторное усиление образца ДНК с помощью GenomePlex WGA3 Reamplification Kit следующим образом: Добавьте 10 йл ДНК в трубку ПЦР (комплект рекомендует 10 нг общей ДНК) с 49,5 мл воды, 7,5 мкл 10x Амплификация Мастер Mix, 3,0 йл 10 мММ DNTP смеси, и 5,0 йл WGA ДНК полимеразы. Смешайте и центрифугу. Используйте следующий профиль для реакции: Храните ДНК при -20 градусов по Цельсию. Этикетка ДНК для FISH с помощью GenomePlex WGA3 Reamplification Kit следующим образом: Создайте мастер-микс из комплекта реамплификации GenomePlex WGA3, добавив 10 МКЛ ДНК в трубку ПЦР с 49,5 мл воды, 7.5 х 10X Amplification Master Mix, 3,0 мкл 1 мм dNTP микс (1 мМ DATP, dCTP, dGTP, 0,3 мкл 1 мм dTTP – при использовании помечены dUTP), 1 мл 25 нм помечены dUTP , и 5,0 йл WGA ДНК полимеразы. Используйте следующий профиль для реакции: Этанол осаждает помеченный зонд, добавляя 1/10 окончательного объема реакции (7,5 л для 75 л реакции) 3 M Acetate pH 5.2 и 2-3 тома 100% этанола. Охладите образец ДНК при -80 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 30 мин. Образец центрифуги при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут для создания помеченных гранул и удаления супернатантных и воздушно-сухих гранул. Создание буфера гибридизации следующим образом:0,2 г декстрана сульфата1200 йл Дейонизированный формамид580 мкл H2O120 х 20X SSC Добавьте 40 мкл буфера гибридизации в высушенные на воздухе гранулы. Усиление ДНК и подготовка зонда через REPLI-G одноклеточный WGA с последующим ник-переводом Следуйте протоколу REPLI-g Single Cell WGA Kit для получения усиленной ДНК: Подготовка буфера D2 (3 мкл 1 М ДТТ и 33 мкл буфер DLB). Смешайте 4 мкл очищенного микродиссектного материала с 3 мкл буфера D2. Флик трубки для смешивания. Инкубация в течение 10 мин при 65 градусов по Цельсию. Добавьте 3 мкл раствора Stop; смешивать. Добавьте в образецбуфер реакции 9мкл H 2 O, 29 мкл REPLI-g Reaction Buffer и 2 мкл полимеразы ДНК REPLI-g. Инкубационный при 30 градусах Цельсия в течение 8 часов. Инактивировать полимеразу ДНК путем нагрева до 65 градусов по Цельсию в течение 3 минут. Храните ДНК при -20 градусов по Цельсию. Следуйте протоколу перевода ника, чтобы обозначить усиленную ДНК REPLI-g: Подготовьте следующую смесь маркировки:1 мкг усиленной ДНК5 х 10X ДНК Полимераза Буфер5 хл 10X dNTP5 хл 1X BSA1 х 1 мМ Маркированная dNTP4 хл 1 U/йл DNase I1 мкл 10 U/L ДНК Полимераза IH2O до 50 мкл Инкубационный при 15 градусов по Цельсию в течение 2 часов. Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию. Проверьте размер фрагмента ДНК, работать на геле. Следуйте по ступенькам от 4.1.4.3-4.1.4.6 к осадке и solubilize гранулы. 5) 2D FISH на препаратах из политена и митотической хромосомы сквоша Пожалуйста, обратитесь к подробным протоколам для FISH о подготовке политен сквош 47 и митотической хромосомы слайды 48. Здесь мы предоставляем краткие протоколы. FISH на препаратах из поликретной хромосомы сквоша Погрузите слайды в 1X PBS в течение 20 минут на СЛАЙДы RT. Fix в 4% Paraformaldehyde в 1X PBS в течение 1 мин. Обезвоживание скользит через этанол моет: 50%, 70%, 90%, 100% в течение 5 минут каждый на RT. Воздух сухие горки. Довоенная зонд в буфере гибридизации при 37 градусов по Цельсию. Добавьте 10-20 мкл зонда для скольжения. Обложка с 22 X 22 мм крышки. Нажмите любые пузырьки воздуха с помощью наконечника пипетки. Денатуратурные хромосомы и зонд при 90 градусах Цельсия в течение 10 мин. Уплотнение края крышки с резиновым цементом. Передача слайда во влажную камеру и инкубировать при 39 градусов по Цельсию на ночь. Вымойте горки с 1X SSC при 39 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Вымойте слайды с 1X SSC на RT в течение 20 минут. Промыть слайды в 1X PBS, а затем добавить продлить анти-fade с DAPI. Обложка с крышкой, и хранить в слайд-бокс при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере за час до визуализации. FISH на митотические хромосомы сквош препаратов Извлекайте митотические хромосомы из воображаемых дисков4-й звездной личинки An. gambiae. Подготовка хромосомных слайдов подходит для FISH. Добавьте 2-3 мкл помеченного зонда ДНК в буфер гибридизации в трубке и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Нанесите 10 мкл смеси зонда на слайд и накройте крышкой 22 X 22 мм. Нажмите любые пузырьки воздуха с помощью наконечника пипетки. Для борьбы с обнаружением и обнаружением, применять продлить анти-fade с DAPI для подготовки и держать в темноте, по крайней мере за час до визуализации. 6) 3D FISH на цельно-монтажной ткани яичников Подготовьте следующее сочетание Buffer A:60 мМ ККл15 мМм НаКл0,5 мМ Спермидин0,15 мМ спермин2 мМ EDTA0,5 мМ ЭГТА15 мМ PIPES Подготовь слайды для ядерной визуализации, добавив слой nailpolish в квадратный узор, чтобы соответствовать размеру coverslips. Это создает поднятую поверхность, чтобы предотвратить раздавливание ядер при размещении на крышке в будущем. Рассекаете свежие яичники из стадии Кристофера 3 женщин и держать в растворе 150-250 мкл буфера с 0,5% дигитонина. Вы запустите большую иглу вскрытия над фолликулами (в трубке с Buffer A с 0,5% дигонином), чтобы уничтожить фолликулярную мембрану. Вихрь в течение 5-10 мин для дальнейшего беспокоить фолликулов. Очистите любые крупные фолликулярные кусочки и центрифугную трубку на 30 сек при наименьшей установке 500 оборотов в минуту (RPM). Передача супернатанта в новую 2 мл Эппендорф трубки, и добавить 100 мкл буфера А. Повторите шаг 6,3 между 5-7 раз, пока видимая ткань разбита на мелкие частицы. Спин обе трубки в течение 10 мин при 2000 об/мин. Откажитесь от супернатанта в обеих трубках. Примечание: Обе трубки будут использоваться для создания окончательных слайдов ядерной визуализации. Трубка с собранным супернатантом должна содержать в основном извлеченные ядра, в то время как оригинальная трубка с тканью будет содержать смесь тканей и ядер, встроенных в клетки медсестры. Добавьте 200 мкл буфера А – 0,1% Тритона и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия. Центрифуга 5 мин при 10 000 об/мин (10 621 х Г) и удалить супернатант. Добавьте 200 йл 4% Параформальдегид в PBS. Инкубировать в термомиксере в течение 30 мин, смешивая при 450 об/мин. Центрифуга 5 мин при 5000 об/мин (2655 х Г) и удалить супернатант. Вымойте с буфером А с 0,1% Тритон в течение 5 минут, смешивая при 450 об/мин в термомиксере. Центрифуга 5 мин при 5000 об/мин (2655 Г) и удалить супернатант. Добавьте предварительно разогретый при 37 градусах по Цельсию помеченный зонд в трубку. Денатура при 95 градусов по Цельсию в термомиксере, смешивание при 450 об/мин, в течение 10 мин. Продолжить денатурацию при 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут с продолжением смешивания. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в термомиксере, с 450 об /мин смешивания на ночь. Центрифуга 5 мин при 5000 об/мин (2655 х Г). Удалите супернатант. Вымойте с буфером С 0,1% Тритон в течение 5 мин. Центрифуга 5 мин при 5000 об/мин (2655 х Г). Повторите 2 раза. Применить капли продлить анти-увядание с DAPI. Трубчатые из ядер / DAPI решение тщательно (избегая пузырьков), применять к слайду, и крышка с coverslip.

Representative Results

На рисунке 1 описывается общий поток протоколов, описанных в данной статье.  Пользователь изначально начинает с микродисразделения образцов хромосомной ДНК с мембранных слайдов.  Микродиссектный материал извлекается и очищается. Очищенная ДНК затем усиливается, усиливается, маркируется, а затем используется для FISH для обозначения хромосомных спредов. Протокол LCM может быть разбит на три общих шага: 1) Поиск хромосом, представляющих интерес, и подготовка региона к резке(рисунок 2A), 2) Резка и катапультирование хромосомы области интереса с помощью лазера (Рисунок 2B), и 3) Проверка, чтобы определить, если образец на самом деле катапультировался в клей крышку (Рисунок 2C). Процесс LCM, используемый на an. gambiae Sua штамма политен хромосомы показано в видео 1. Видео подробно весь процесс от запуска программы, в том числе важные функции программного обеспечения и советы. Комплекты GenomePlex и REPLI-g, используемые в этом протоколе, сильно отличаются размером продукта, а также общей урожайностью.  На рисунке 3 показаны результаты гелеобразования, продихаемого для комплектов GenomePlex и REPLI-g, а также количественная оценка образцов Nanodrop. Микродиссектный материал был использован для создания зондов FISH, которые нацелены на эвхроматические области хромосомы.  На рисунке 4 демонстрируется FISH пяти зондов, генерируемых из микродиссектированного материала на политенных хромосомах An. gambiae.  Четыре аутосомные руки были помечены тремя флюорофорами с использованием комплекта WGA3: 3R-хромосома помечена зеленым цветом (флуорессейн), 3L-хромосома находится в смеси красного (Cy-3) и желтого цвета (Cy-5), 2R-хромосома в желтом цвете (Cy-5), а хромосома 2L в красном цвете (Cy-3). Х-хромосома была помечена оранжевым цветом (Cy-3) с использованием ник-перевода материала REPLI-g в отдельном эксперименте. Для установления соответствия между эвхроматических частей политен и митотических хромосомных рук, хромосомные краски были гибридизированы для интерфазы, профазы, прометафазы и метафазных хромосом An. gambiae (рисунок 5).  Для визуализации 3D-организации одной политеной хромосомы руки в ядре клетки, вся гора FISH была выполнена на An. gambiae Sua штамма яичников клетки медсестры (Видео 2).  Различные хромосомные территории руки хорошо видны в ядрах с интерфазом(рисунок 5D)и политеной (видео 2) хромосомами. Рисунок 1. Схематическое представление экспериментальных процедур по подготовке хромосомных красок. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 2. Основные шаги в хромосомной микропересмешивании. A) Лазерная резка хромосомной области, представляющих интерес через мембрану. B) Мембрана с отверстием после катапультирования выполняется. C) Вид катапультированной части мембраны с хромосомным сегментом в ней, прикрепленный к клейкой крышке. Стрелка указывает на хетерохроматин Х-хромосомы, который остался на слайде. Звездочка показывает кусок другой хромосомы, которая осталась на слайде. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 3. Агароза гель изображения, показывающие ДНК после WGA. A) Низкий молекулярный вес (200-500 bp) ДНК от руки 3R после использования комплектов WGA4 и WGA3 GenomePlex. B) Высокий молекулярный вес (10-20 кб) ДНК из руки 2L после усиления REPLI-g. Лестница 100 bp показана в левой полосе движения. Таблицы ниже гель изображения показывают концентрации ДНК измеряется Nanodrop. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 4. Картина политеных хромосом из клеток медсестры яичников An. gambiae с использованием четырех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала. Х-хромосома помечена оранжевым цветом (Cy-3) ник-переводом материала REPLI-g. Рука 2R помечена желтым цветом (Cy-5); 2L рука в красном (Cy-3); 3R рука помечена зеленым цветом (фторсейн); 3L рука помечена в смеси красного (Cy-3) и желтого (Cy-5). Автосомы помечены комплектом усиления WGA3. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Названия хромосом расположены вблизи теломерных областей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Рисунок 5. Картина межфазы (A), профазы (B), прометафазы (C) и метафазы (D) хромосом из личиночных воображаемых дисков штамма An. gambiae Mopti с использованием трех зондов, генерируемых из микродиссектированного материала, помеченного WGA3. Рука 2R помечена зеленым цветом (флуорессейн); рука 2L не помечена; 3R рука в розовом, смесь красного (Cy-3) и оранжевый (Cy-5); рука 3L помечена оранжевым цветом (Cy-5). Х-хромосома имеет красную метку, соответствующую зонду 18S rDNA. Хроматин окрашен в синий цвет (DAPI). Ярко окрашенные области хромосом соответствуют хетерохроматину. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. Видео 1. Процесс LCM хромосом An. gambiae polytene. Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 1. Видео 2. Целый крепление 3D FISH выполняется на An. gambiae клетки медсестры яичников. Зонд помечен в Cy-3 (изображен синим цветом) и сделан из микродиссектной руки 2R-хромосомы.  Хроматин был окрашен в DAPI и изображен голубой псевдоцветной (светло-голубой). Нажмите здесь, чтобы просмотреть видео 2.

Discussion

Есть несколько шагов, критически важных для успешного усиления ДНК из микродиссектных образцов политеной хромосомы. Протокол использует LCM, метод, который как повышает общую эффективность и снижает воздействие чужой ДНК путем удаления взаимодействия физических инструментов с образцом. Тем не менее, усиление чужой ДНК по-прежнему является самой большой потенциальной ловушкой этого эксперимента. Таким образом, в течение всего процесса необходимо держать образцы защищенными от загрязнения. На протяжении всего слайд подготовки и микродиссекции фазы, важно, чтобы этанол мыть вскрытия иглы, слайды, крышка скользит, а также рабочее пространство.  Также рекомендуется уфимец обработать все применимое оборудование (иглы, горки, крышки) перед использованием.

Мембрана на слайдах вскрытия делает распространение хромосом очень трудным.  Важно использовать больше яичников (половина до полной пары яичников) при принятии этих слайдов, чтобы обеспечить больше шансов найти хорошо распространения ядра.  Также рекомендуется использовать свежие ткани при создании слайдов, так как показатели усиления, как представляется, падают, как ткани возрасте 49 лет и хромосомы распространения становится все более сложной задачей.  Подготовка слайдов для микропересмешки является наиболее трудоемким шагом в этом протоколе.  Хромосомы должны быть хорошо распространены, чтобы избежать случайного приобретения нежелательного материала.  Окрашивание Giemsa позволяет пользователю проверить качество распространения с помощью фазового контрастного микроскопа перед использованием системы микропереписьа.

Сочетание микродиссеции и усиления дает возможность извлекать и анализировать хромосомные фрагменты размером от небольших областей, представляющих интерес для большинства вооружений.  Этот протокол позволяет пользователю получить ДНК из морфологически различных регионов, таких как инверсии, специфические эвхроматические полосы и интербанды, теломерные, центрометрические и межкалорийные хетерохроматин. Пользователь может применить генерируемые зонды живописи к изучению аномальных хромосом, изучению меж видам гомологии в определенных локусах или характеристике пространственной организации хромосом в нетронутом 3D ядре. Для разработки хромосомных красок мы выбрали эухроматические сегменты, чтобы избежать гибридизации повторяющейся ДНК с несколькими хромосомными областями. В результате мы получили картину, специфичную для рук, без использования конкурента, например, геномнуюДНК или фракцию ДНКC 0 t-1.

Мы решили использовать GenomePlex WGA и REPLI-G комплекты на основе обзоров, которые сравнили эффективность и уровень отсева нескольких комплектов усиления 40,44.  Оба комплекта показали лучшие результаты среди доступных методов в обоих отсева (GenomePlex был 12,5% ставка по сравнению с REPLI-G в 37,5%) и процент усиленных маркеров (GenomePlex имел 45,24% уровень усиления против 30,0%) 40.Комплект GenomePlex также предоставил большее количество ДНК, и, таким образом, сделал его лучшим кандидатом для нескольких методов вниз по течению.  Также имеется комплект для повторного усиления системы GenomePlex, позволяющий еще больше подколоть ДНК. Однако важно отметить, что усиление не является совершенным.  Остается возможность того, что успешное усиление может привести к ошибкам или иметь уклон в сторону конкретных локусов в целевой ДНК. Важно рассмотреть окончательный размер фрагмента имеющихся методов усиления генома.  Фрагментация GenomePlex приводит к библиотеке с фрагментами от 200-500 bp, в то время как комплект REPLI-g производит фрагменты размером примерно 10-20 кб. Предполагаемое применение этого протокола ниже по течению является FISH, что делает комплект GenomePlex более осуществимым вариантом, поскольку он обеспечивает желаемый размер фрагмента и возможность маркировать фрагменты ДНК непосредственно через WGA. Длинные молекулы ДНК, производимые усилением REPLI-g, должны быть фрагментированы в реакции маркировки ник-перевода ниже по течению.

Этот протокол был адаптирован для успешного усиления ДНК из одной руки политеной хромосомы.  Другие протоколы требуют объединения многих (обычно 10-30) фрагментов хромосом для того, чтобы успешно усилить образец 7,11,28,40.  Хотя объединение нескольких хромосом возможно с помощью нашего метода, повышенная вероятность загрязнения образца подчеркивает важность начала эксперимента с как можно меньше хромосом. Если политен хромосомы не доступны, наш протокол может быть адаптирован для использования в митотических хромосомах. Это может быть необходимо, однако, объединить 10-15 митотических хромосом до усиления для успешного FISH 11. Смещение усиления ниже с большим количеством исходного шаблона DNA 50. Политеновые хромосомы обеспечивают приблизительно 512 копий одной последовательности ДНК и 1024 копии двух гомологичные последовательности ДНК.  Таким образом, объединение митотических хромосом поможет повысить общее качество продукта ДНК после усиления.

Эта процедура имеет много потенциальных применений в цитогенетических и геномных исследованиях. Здесь мы использовали хромосомные краски для установления соответствия между эухроматических сегментов политен и митотической хромосомы оружия в An. gambiae. Те же зонды живописи могут быть применены к цитогенетическим характеристикам линий клеток An. gambiae. Обширные геномные перестановки и изменения в числах хромосом являются общими особенностями клеточных линий 51,52. Анеуплоидия, полиплоидия и хромосомные перестановки, такие как транслокации, инверсии, удаления и кольцевые хромосомы были обнаружены в различных линиях клеток комаров 53,54. Классические цитогенетические наблюдения 55 и физическое картирование 56 продемонстрировали возникновение хромосомных транслокаций в эволюции малярийных комаров. Таким образом, микродиссектный материал может быть использован в сочетании с экспериментами FISH для сравнения гомологии хромосомных областей между видами. Мы успешно выполнили 3D FISH с 2R-картинным зондом на политеновых хромосомах в клетках медсестры в целом. Этот метод облегчит отслеживание хромосомных траекторий и изучение ядерной архитектуры в Anopheles. Такие методы, как генотипирование ДНК 57,58, секвенирование генома следующего поколения 26,27, физическое и соединение карты развития, и генерации зондов для хромосомной живописи 33,59 все могут извлечь выгоду из руки и региона конкретных микродиссекции. Объединив технологию LCM и продвигая одноклеточную WGA, мы демонстрируем эффективный, практичный метод производства разумного количества ДНК из одной политеной хромосомы руки.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения 1R21AI094289 Игорю В. Шарахову

Materials

Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen  P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen  AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen  P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
  2. Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
  3. Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
  4. Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
  5. Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
  6. Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
  7. Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
  8. Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
  9. Kokhanenko, A. A., Anan’ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
  10. Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
  11. Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
  12. Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
  13. Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
  14. Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
  15. Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
  16. Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
  17. Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
  18. Zhimulev, I. F. . Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, 1-490 (1996).
  19. Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , (2008).
  20. Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, d. e. l. l. a., Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
  21. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
  22. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
  23. Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
  24. Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
  25. Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
  26. Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
  27. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
  28. Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
  29. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
  30. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
  31. Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
  32. Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
  33. Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
  34. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
  35. Hutchison, C. A., 3rd, J. C., Venter, Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
  36. Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
  37. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
  38. Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
  39. Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
  40. Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
  41. Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
  42. Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
  43. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
  44. Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
  45. Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
  46. Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
  47. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
  48. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
  49. Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
  50. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
  51. Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
  52. Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , (1534).
  53. Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
  54. Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
  55. Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
  56. Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
  57. Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
  58. Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
  59. Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).

Tags

Chromosome PaintingFISHLaser Capture MicrodissectionWhole Genome AmplificationAnopheles GambiaeMalaria MosquitoPolytene ChromosomeChromosome OrganizationCytogenetics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
George, P., Sharma, A., Sharakhov, I. V. 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (83), e51173, doi:10.3791/51173 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image