マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

1) レーザー捕捉マイクロ解剖のためのポリテーン染色体スライド調製 25時間のポスト・フィードで半グラビッド ・アノフェレス の女性を解剖する。約5人の女性の卵巣を、室温で500μlの新鮮な変性カルノイ溶液(メタノール100%:氷河酢酸、3:1)に24時間固定します。長期保存のために-20°Cに卵巣を移す。 カルノイ溶液(100%エタノール:氷酢酸、3:1)と50%プロピオン酸を染色体スライドの直前に調製します。 ツァイス1.0 PET膜スライド上のカルノイ溶液の1滴に卵巣の1組を置きます。サイズに応じて、卵巣を解剖針で約2〜4個のセクションに分割し、解剖顕微鏡下のきれいなスライドに50%のプロピオン酸の低下に置きます。 毛包を分離し、解剖実体顕微鏡下でペーパータオルを使用して残りの組織を除去する。卵胞に50%プロピオン酸の新しい滴を加え、室温で3〜5分間座るようにします。 シリコン化カバースリップを液滴の上に置きます。スライドを約1分間放置します。 スライドを吸収材で覆い(この方法ではフィルターペーパーを使用)、鉛筆の消しゴム側を使用しながら、消しゴムで繰り返しタップしてカバースリップに寛大な圧力を加えます。 スライド変性/ハイブリダイゼーションシステムでスライドを60°Cに15〜20分間加熱し、ポリテーン染色体の平坦化を支援します。一晩4°Cの湿気の多いチャンバーにスライドを入れ、酸が染色体をさらに平らにできるようにします。 冷たい50%エタノールにスライドを10分間入れる。カバースリップをそっと取り出し、冷たい50%エタノールで10分交換します。 脱水スライドを70%、90%、100%エタノールずつ5分間乾燥させる。空気乾燥スライド。 1Lの蒸留水に単一の緩衝剤を添加してGURR緩衝液の溶液を調製する。オートクレーブ。 50 ml の GURR バッファーに 1 ml の Giemsa 染色液を加えて Giemsa 溶液を調製します。 10分間、ギームサ溶液に空気乾燥スライドを入れ、1X PBSで3回洗浄します。空気乾燥は汚染を避けるために制御された無菌の気候で再び滑る。 2)単一ポリテーン染色体アームのレーザー捕捉マイクロディセクション このセクションでは、PALMマイクロビームレーザーマイクロディセクショクシステムに付属のPALMRoboソフトウェアの使用について詳しく説明します。 100%エタノールで顕微鏡を洗浄してください。UVクロスリンカーでUV光で手袋やチューブを殺菌します。 PALMマイクロビームレーザーマイクロディション顕微鏡の電源を入れ、レーザーをオンにします。レーザー解剖スイート、PALMRoboを開き、必要に応じて「パワー」と「フォーカス」の設定を構成します。 関心のあるポリテン染色体アームを検索します。 「鉛筆」ツールを使用して、選択した領域の輪郭を描きます。 メニューバーから「要素」ウィンドウを開きます。 「描画要素」を選択し、「カット」を選択したことを確認します。 粘着キャップチューブをホルダーに取り付け、スライドの上に小さな隙間<1mmを残して、レーザーカットを開始します。 カット部位内に「カタパルト選択」を配置し、縁と染色体の間にスペースを残します。 ドロップダウンオプションから「LPC」を選択し、カタパルトを開始します。 「目」アイコンを押して、サンプルがキャップにカタパルトされたことを確認します。 3) 単一のマイクロ分解されたポリテーン染色体アームからのDNAの精製 QIAamp DNAマイクロキットの指示に従って、収集したDNAを放出して精製します。ステップ3.1は、反転管を収容するように修正されました。 15 μl バッファー ATL と 10 μl プロテイナーゼ K を反転チューブ(キャップの内側)に加え、56 °Cで3時間インキュベートします。 25 μl バッファー ATL、50 μl バッファー AL、および 1 μl キャリア RNA を追加します。ミックス. 50 μl 100% EtOH を追加します。混ぜる。 リセートをQIAampカラムに移す;遠心機。500 μl バッファー AW1 を追加して洗浄します。遠心機。新しいコレクションチューブにカラムを配置し、500 μlバッファAW2を追加します。遠心機。新しいチューブに柱を配置します。余分な液体を除去するために遠心分離機。 カラムを1.5μlマイクロ遠心チューブに入れ、20μlの水を溶出させます。遠心機。 真空化したDNAを真空化した状態で9μlの最終体積まで蒸発させる。 4) 単一のマイクロ分解されたポリテーン染色体アームからのDNAの増幅 2つの異なるプロトコルが、単一の染色体アームのWGAに使用された。 ゲノムプレックスWGAによるDNA増幅とプローブ調製 GenomePlex シングルセル WGA4 キット プロトコルに従って、増幅 DNA の最初のバッチを生成します。 9 μl サンプルに作りたてのプロテイナーゼ K溶液を加えます。混合.50°CでDNAを1時間インキュベートし、99°Cに加熱して4分間加熱します。氷の上に置いておきなさい。 2 μl 1X シングルセルライブラリ調製バッファーと 1 μl のライブラリ安定化ソリューションを追加します。混ぜる. 95 °Cに2分間加熱します。氷と遠心分離機で冷やします。 ライブラリ調製酵素の1 μlを追加します。ミックスと遠心分離機。次のようにインキュベートします。 7.5 μl 10X 増幅マスターミックス、48.5 μl水を加えます。5.0 μl WGA DNAポリメラーゼ;ミックスと遠心分離機。 以下のようなサーモサイクル: ゲノムDNAクリーン&コンセントレータキットを使用してDNAを精製します。プロトコルは次のとおりです。 5:1 DNA結合バッファー:DNAサンプルを追加します(特に2kb未満のゲノムDNAに対して。サンプルDNAが2kbを超える場合は、2:1比を使用し、提供されたスピンカラムに転送します。遠心機。 200 μl の DNA 洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。洗浄工程を繰り返します。その後、50 μlの水を加え、DNAを新しい1.5 mlチューブに溶出させます。 GenomePlex WGA3 再増幅キットを使用してサンプル DNA を次のように再増幅します。 PCRチューブに10 μl DNA(キットは合計10 ngのDNAを推奨)、49.5 μlの10x増幅マスターミックス、3.0 μl 10 mM DNTPミックス、5.0 μl WGA DNAポリメラーゼを加えます。ミックスと遠心分離機。 反応には以下のプロファイルを使用します。 DNAを-20°Cに保存する。 ゲノムプレックス WGA3 再増幅キットを使用して FISH の DNA を次のようにラベル付けします。 49.5 μlの水を含むPCRチューブに10 μl DNAを加えることで、ゲノムプレックス WGA3 再増幅キットからマスターミックスを作成し、 7.5 μl 10X 増幅マスターミックス、3.0 μl 1 mM dNTP ミックス (1 mM dATP、dCTP、dGTP、0.3 μl 1 mM dTTP – ラベル dUTP を使用する場合)、25 nM ラベル dUTP の 1 μl、および5.0 μl WGA DNAポリメラーゼ。 反応には以下のプロファイルを使用します。 エタノールは、3 M酢酸ナトリウムpH 5.2および100%エタノールの2〜3容量の最終反応容積(75μl反応に対して7.5 μl)を1/10に添加することにより標識プローブを沈殿させます。DNAサンプルを-80°Cで少なくとも30分間冷やします。 遠心分離機サンプルを4°Cで10分間、ラベル付きペレットを作成し、上清および空気乾燥ペレットを除去します。 次のように、ハイブリダイゼーション バッファを作成します。0.2 g デキストラン硫酸1200 μl 脱イオン化フォームアミド580 μl H2O120 μl 20X SSC 空気乾燥ペレットに40 μlのハイブリダイゼーションバッファーを加えます。 REPLI-GシングルセルWGAによるDNA増幅とプローブ調製、続いてニック翻訳 REPLI-g シングルセル WGA キットプロトコルに従って、増幅された DNA を生成します。 バッファー D2 (3 μl の 1 M DTT + 33 μl バッファー DLB) を準備します。 精製されたマイクロディスセクテッド材料の4 μlを3 μlのバッファーD2と混合します。ミックスするフリックチューブ。65°Cで10分間インキュベートします。 ストップソリューションを3 μl追加します。混ぜる。 9 μl H2O、29 μl の REPLI-g反応バッファー、および 2 μl の REPLI-g DNA ポリメラーゼをサンプルに加えます。30°Cで8時間インキュベートします。65°Cに加熱して3分間加熱することによりDNAポリメラーゼを不活性化する。DNAを-20°Cに保存する。 NICK 変換プロトコルに従って、REPLI-g 増幅 DNA のラベルを付けます。 次のラベリングミックスを準備します。増幅DNA 1 μg5 μl 10X DNA ポリメラーゼバッファー5 μl 10X dNTP5 μl 1X BSA1 μl 1 mM ラベル付き dNTP4 μl 1 U/μl DNase I1 μl 10 U/μl DNAポリメラーゼ IH2O~50 μl 15°Cで2時間インキュベートします。0.5 M EDTAの2 μlを加え、反応を止めてください。ゲルで動作させることでDNAフラグメントサイズを確認します。 ペレットを沈殿させ、可溶化するために 4.1.4.3-4.1.4.6 からのステップに従ってください。 5)ポリテーンおよびミトティック染色体スカッシュ製剤上の2D FISH ポリテーンスカッシュ 47 および有糸分裂性染色体スライド 48の準備については、FISHの詳細なプロトコルを参照してください。ここでは、簡単なプロトコルを提供します。 ポリテーン染色体スカッシュ製剤上のFISH RTで20分間1X PBSにスライドを浸し、1X PBSで4%パラホルムアルデヒドのスライドを1分間修正します。 エタノールの流れによって脱水スライド:50%、70%、90%、100%RTで5分のための。空気乾燥スライド。 プローブをハイブリダイゼーションバッファーで37°Cで予熱する。 スライドするプローブを10~20μl追加します。カバーは22×22mmのカバースリップです。ピペットチップを使用して気泡を押し出します。 染色体を変性させ、90°Cで10分間プローブを変性する。カバースリップのシールエッジにゴムセメントを付けます。滑り込み気湿ったチャンバーに移し、一晩で39°Cでインキュベートします。 スライドを39°Cで1X SSCで20分間洗います。RTで1X SSCでスライドを20分間洗います。1X PBSでスライドをすすい、DAPIで延長アンチフェードを追加します。カバースリップで覆い、視覚化の前に少なくとも1時間は4 °Cのスライドボックスに保管してください。 有糸分裂性染色体スカッシュ製剤上のFISH アンガンビアの4番目のインスター幼虫の想像力の円盤から有糸分裂性染色体を抽出する。 FISHに適した染色体スライドを準備します。 2~3 μlの標識DNAプローブをチューブ内のハイブリダイゼーションバッファに加え、ピペット処理で軽く混合します。 10 μlのプローブ混合物をスライドに塗布し、22 X 22 mmのカバースリップでカバーします。ピペットチップを使用して気泡を押し出します。 対抗および検出の場合は、DAPI によるアンチフェードを延長して準備を行い、可視化の前に少なくとも 1 時間は暗闇の中に保管してください。 6)全体マウント卵巣組織上の3D FISH 次のバッファ A ミックスを準備します。60 mM KCl15 mM ナクル0.5 mM スペルミジン0.15 mM スペルミン2 mM EDTA0.5 mM EGTA15 mMパイプ カバーリップのサイズに合わせて正方形のパターンでマニキュアの層を追加することにより、核の視覚化のためのスライドを準備します。これにより、将来カバースリップに置くときに核の押しつぶしを防ぐために、表面を隆起させます。 クリストファーのステージ3メスから新鮮な卵巣を解剖し、0.5%デジコニンを有する150-250 μl緩衝液Aの溶液に保つ。卵胞膜を破壊するために卵胞(0.5%デジトニンを持つ緩衝管で)の上に大きな解剖針を実行します。 5〜10分間の渦をさらに邪魔する。1分間に500回転(RPM)の最低設定で、大きな濾胞片と遠心管 を 30秒間削り取ります。上清を新しい2mlエペンドルフチューブに移し、100 μlのバッファAを加え、目に見える組織が小さな粒子に割れるまで、ステップ6.3を5~7回繰り返します。 2,000 RPMで10分間、両方のチューブを回転させます。両方のチューブに上清を捨てます。 注: 両チューブは、最終的な核可視化スライドの作成に使用されます。収集された上清を有するチューブは主に抽出された核を含み、組織を持つ元のチューブには看護師細胞に埋め込まれた組織と核の混合物が含まれるべきである。 バッファーA – 0.1%トリトンの200 μlを加え、4°Cで一晩インキュベートします。 遠心分離機 10,000 RPM (10,621 x G) で 5 分、上清を除去します。 PBSに200μl 4%パラホルムアルデヒドを加えます。450 RPMで混合し、30分間、サーモミキサーでインキュベート。5,000 RPM(2,655 x G)で5分の遠心分離機を使用し、上清を除去します。0.1%トリトンで5分間バッファAで洗浄し、サーモミキサーで450 RPMで混合します。5,000 RPM (2,655 G) で 5 分遠心分離機を使用し、上清を除去します。 37°C標識プローブで予温してチューブに加えます。サーモミキサーで95°Cで変性し、450RPMで10分間混合します。混合を続けて80°Cで15分間変性を続けます。サーモミキサーで37°Cでインキュベートし、一晩450 RPM混合します。5,000 RPMで5分の遠心分離機(2,655 x G)。上清を除去します。 0.1%トリトンで5分間バッファAで洗います。5,000 RPMで5分の遠心分離機(2,655 x G)。2回繰り返します。DAPIで延長アンチフェードのドロップを適用します。 核/DAPI溶液を慎重にパイプアウト(気泡を避ける)、スライドに適用し、カバースリップで覆います。