ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).
פלואורסצנט בהכלאה במקום (FISH) של בדיקות כרומוזום זרוע שלמות היא טכניקה איתנה למיפוי אזורים גנומיים מעניינים, גילוי סידורים מחדש כרומוזומליים וחקר ארגון כרומוזומים תלת מימדי (3D) בגרעין התא. הופעתו של microdissection לכידת לייזר (LCM) והגברת הגנום כולו (WGA) מאפשר קבלת כמויות גדולות של DNA מתאים בודדים. הרגישות המוגברת של ערכות WGA גרמה לנו לפתח צבעי כרומוזום ולהשתמש בהם לחקר ארגון כרומוזום ואבולוציה באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד ולהגברת מקטעי האוכרומטיות של זרועות כרומוזום פוליטן יחיד מתאי אחות השחלות של יתוש המלריה האפריקאי אנופלס גמביה. הליך זה מספק פלטפורמה יעילה להשגת צבעי כרומוזום, תוך הפחתת הסיכון הכולל להחדרת דנ”א זר לדגימה. השימוש ב- WGA מאפשר מספר סבבים של הגברה מחדש, וכתוצאה מכך כמויות גבוהות של DNA שניתן להשתמש בהם לניסויים מרובים, כולל דגים דו-ממדיים ותלת-ממדיים. הוכחנו כי צבעי הכרומוזום המפותחים יכולים לשמש בהצלחה כדי לבסס את ההתאמה בין חלקים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. בסך הכל, האיחוד של LCM ו- WGA של כרומוזום יחיד מספק כלי יעיל ליצירת כמויות משמעותיות של דנ”א יעד למחקרים ציטוגנטיים וגנומיים עתידיים.
ציור כרומוזום היא טכניקה שימושית לחקר האבולוציה של קריוטיפים 1-5 ולהמחיש מומים ציטוגנטיים באמצעות הכלאה של DNA כרומוזומלי שכותרתו פלואורסצנטית 1,6-8. שיטה זו מיושמת גם על לימוד הדינמיקה התלת מימדית של שטחי כרומוזום בפיתוח 9 ופתולוגיה 10. צבעי כרומוזום המסומנים באופן דיפרנציאלי משמשים להדמיה של מיטוטי יחיד 11,12, מיוטי 13,14, או שאינם פוליטנים בין-פאזיים 15,16 ופוליטן 9,11,17 כרומוזומים. פרוטוקול פשוט וחזק להשגת צבעי כרומוזום יהיה שימושי מאוד בהרחבת טכניקה זו לאורגניזמים שאינם מודל, כגון יתושים. מתחם Anopheles gambiae הוא קבוצה של שבעה יתושים בלתי ניתנים להבחנה מורפולוגית המשתנים בהתנהגות ובהסתגלות, כולל היכולת להעביר מלריה. יתושים אלה משמשים מודל מצוין כדי להבין טוב יותר את האבולוציה של מינים קרובים כי שונים מאוד ביכולת הווקטורית שלהם. רוב המחקרים הציטוגנטיים יתושים מלריה נעשו באמצעות מפותחים, כרומוזומים פוליטניים מאוד (נבדק ב 18,19). דפוסי הפסים הקריאים של כרומוזומי פוליטן אפשרו לחוקרים להדגים את הקשר בין היפוכים פולימורפיים לבין התאמות אקולוגיות ב Anopheles gambiae 20. כמו כן, תכונות ספציפיות לרקמות של 21 ומינים של כרומוזום פוליטן תלת-ממדי התאפיינו במתחם An. macullipennis. עם זאת, לימוד כרומוזומים מיטוטיים יכול לספק מידע חשוב נוסף. לדוגמה, רמה גבוהה יותר של פולימורפיזם הטרוכרומטין שנצפה בכרומוזומים מיטוטיים כבר בקורלציה עם פעילות הזדווגות מופחתת ופוריות ב An. gambiae 23. קשה לבסס את ההתאמה בין מקטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי רק על ידי השוואת אורכיהם היחסיים. הסיבה לכך היא שהטרוכרומטין מהווה חלק משמעותי בכרומוזומים מיטוטיים, אך אינו מיוצג בכרומוזומים פוליטנים 24. הזמינות של צבעי כרומוזום ליתושים מלריה תאפשר לחוקרים להרחיב באופן משמעותי מחקרים ציטוגנטיים על ידי הכללת מינים נוספים, תוך צמצום משמעותי של העלות והזמן בניתוחים של האבולוציה הקריוטיפית והדינמיקה התלת מימדית של כרומוזומים בקבוצה זו של חרקים חשובים מבחינה אפידמיולוגית.
על מנת להשיג קטעים גדולים של כרומוזומים, microdissection הפך טכניקה אינטגרלית כדי לתפעל ולבודד אזורים ספציפיים של עניין של המשלים כרומוזומלי. בשילוב עם הגברה גנומית שלמה (WGA), מיקרו-דיסקציה גורמת ליישומים רבי עוצמה במורד הזרם כולל FISH 11,12 ו רצף הגנום של הדור הבא 25-27. בעבר, הטכניקה דרשה שימוש במחטי microdissection מיוחדים שהיו צריכים להיות נשלטים באופן ידני על ידי משתמש מנוסה 28. ההתקדמות של microdissection לכידת לייזר (LCM) הביא כלי פשוט מתאים יותר עבור בידוד תאים בודדים 29,30 או כרומוזומים בודדים 31-33 עם סיכון פחת של זיהום. גישה זו מאפשרת למשתמש לחקור את ההטרוגניות הגנטית ואת מומים כרומוזומליים המתרחשים בתאים בודדים, במקום נוף קונצנזוס הנובע מאיגום תאים מרובים יחד 34-36. נעשה שימוש בשיטות מרובות כדי להגביר את הדנ”א המופק ממיקרו-דיסקציה. DOP-PCR, טכניקה שימושית להגברת רצפים שחוזרים על עצמו מאוד, שימשה להגברת כרומוזומים microdissected ממינים כולל חגב 37, צלופחים קוצניים 38, ואת אמנון הנילוס 39. לאחרונה, ערכת תא יחיד GenomePlex WGA4 מבוסס PCR והגברת תזוזה מרובה מבוסס (MDA) Repli-G תא יחיד ערכה הפכו כלים יקרי ערך לניסויים מעורבים ניתוח גנטי של תאים אנושיים בודדים, כמו גם כרומוזומים40-42, כולל מערכות כרומוזום B בחגבים 37 ו ארבה 43. שתי ערכות אלה כל אחד יש יתרונות וחסרונות, אבל העליונות לכאורה שלהם מעל מערכות הגברה זמינות אחרות הוכח 44.
כמות הדנ”א שניתן להשיג מכרומוזום יחיד או מקטע כרומוזום נמוכה משמעותית מזו של גרעין שלם. לכן מיקרו-דיסקציה, הגברה וניתוח עוקב של כרומוזום יחיד הם הרבה יותר מאתגרים, במיוחד באורגניזמים עם גנומים קטנים כמו בדרוסופילה או אנופלס. למרות צבעים פותחו כרומוזומים microdissected יחיד של אדם 33 ו צריעה 45, ניסוי FISH מוצלח נדרש מרובים (לפחות 10-15) כרומוזומים מיטוטיים microdissected של זבוב פירות 11. עם זאת, היכולת microdissect ולהגבר כרומוזום יחיד יהיה חשוב עבור (i) הפחתת הסיכוי לזיהום עם חומר כרומוזום שונה, (ii) צמצום מספר ההכנות כרומוזומליות הדרושות microdissection, (iii) הפחתת נוקלאוטידים ופולימורפיזם מבני של המדגם microdissected הן FISH ו רצף במורד הזרם יישומים. כרומוזומי פוליטן המצויים במינים דיפטרניים רבים מציעים הזדמנות ייחודית לרכוש כמות התחלתית גבוהה בהרבה של דנ”א. הם גם מספקים רזולוציה גבוהה יותר ומבנה כרומוזום שלא ניתן להשיג באמצעות כרומוזומים מיטוטיים. רזולוציה נוספת זו יכולה להיות קריטית בהדמיית סידורים מחדש כרומוזומליים, מבנה כרומטין ומקטעים כרומוזומליים להיות microdissected 28,46.
כאן אנו מציגים הליך לבודד ביעילות קטע אוכרומטי מזרוע כרומוזום פוליטן יחיד, להגביר את ה- DNA, ולהשתמש בו ביישומי FISH במורד הזרם יתושים מלריה. ראשית, אנו מיישמים LCM כדי לבודד ולחלץ זרוע כרומוזום אחת ממגלשות קרום שהוכנו במיוחד. שנית, WGA משמש כדי להגביר את ה-DNA מהחומר microdissected. שלישית, אנו הכלאה DNA מוגברת בניסויים FISH כדי polytene הכנות סקווש 47, metaphase ו שקופיות כרומוזום interphase 48, כמו גם דגימות הר שלמות השחלות 3D. הליך זה נעשה כדי לצייר בהצלחה את רוב האוכרומטין בזרועות כרומוזומליות של An. gambiae.
ישנם שלבים רבים קריטיים כדי להגביר בהצלחה את ה-DNA מדגימות כרומוזום פוליטן microdissected. הפרוטוקול משתמש בשימוש ב- LCM, שיטה הן מגבירה את היעילות הכוללת ומפחיתה את החשיפה לדנ”א זר על ידי הסרת האינטראקציה של כלים פיזיים עם הדגימה. עם זאת, הגברה של דנ”א זר היא עדיין המלכודת הפוטנציאלית הגדולה ביותר של ניסוי זה. לכן, במהלך כל התהליך, זה חיוני כדי לשמור על הדגימות מוגנות מפני זיהום. לאורך כל הכנת שקופית ושלבי microdissection, זה חיוני כדי לשטוף אתנול מחטי דיסקציה, שקופיות, לכסות מעידות, כמו גם את סביבת העבודה. מומלץ גם UV לטפל בכל הציוד הישים (מחטים, שקופיות, coverslips) לפני השימוש.
הממברנה על שקופיות הניתוח מקשה מאוד על התפשטות הכרומוזומים. חשוב להשתמש יותר של השחלה (חצי לזוג מלא של שחלות) בעת ביצוע שקופיות אלה, כדי לספק סיכוי גדול יותר למצוא גרעין התפשטות היטב. מומלץ גם להשתמש ברקמה טרייה בעת ביצוע שקופיות, כמו שיעורי הגברה נראה לרדת כמו רקמות גיל 49 והתפשטות כרומוזום הופך להיות מאתגר יותר. הכנת שקופיות עבור microdissection הוא הצעד זמן רב ביותר בפרוטוקול זה. כרומוזומים חייבים להתפשט היטב כדי למנוע רכישה בשוגג של חומר לא רצוי. כתמי Giemsa מאפשרים למשתמש לבדוק את איכות ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני השימוש במערכת המיקרו-דיסקציה.
השילוב של מיקרו-דיסקציה והגברה מספק את ההזדמנות לחלץ ולנתח שברים כרומוזומליים בגודלם מאזורים קטנים בעלי עניין לרוב הזרועות. פרוטוקול זה מאפשר למשתמש להשיג דנ”א מאזורים שונים מבחינה מורפולוגית כגון היפוכים, רצועות אוכרומטיות ספציפיות וסרטים בין-דוריים, הטרוכרומטין טלומרי, סנטימטרי ובין-כוכבי. המשתמש יכול ליישם את בדיקות הציור שנוצרו כדי לבחון כרומוזומים חריגים, לחקור הומולוגיה בין מינים בלוקוסים מסוימים, או לאפיין ארגון מרחבי של כרומוזומים בגרעין תלת מימד שלם. לפיתוח צבעי כרומוזום, בחרנו מקטעים אוכרומטיים כדי למנוע הכלאה של דנ”א חוזר עם אזורים כרומוזומליים מרובים. כתוצאה מכך, השגנו ציור ספציפי לזרוע מבלי להשתמש במתחרה, כמו דנ”א גנומי כולל או שבר DNA C0t-1.
בחרנו להשתמש בערכות GenomePlex WGA ו- REPLI-G בהתבסס על ביקורות שהשוו את יעילות ושיעור הנשירה של ערכות הגברה מרובות 40,44. שתי הערכות ביצעו את הטוב ביותר מבין השיטות הזמינות בשני שיעור הנושרים (GenomePlex היה שיעור של 12.5% לעומת 37.5% של REPLI-g%) ואחוז הסמנים המוגברים (ל-GenomePlex היה שיעור הגברה של 45.24% לעומת 30.0% של REPLI-g). 40. ערכת GenomePlex סיפקה גם כמות גבוהה יותר של DNA, ובכך הפכה אותה למועמדת טובה יותר לטכניקות מרובות במורד הזרם. ערכת הגברה מחדש למערכת GenomePlex זמינה גם היא, ומאפשרת הגברה נוספת של הדנ”א. עם זאת, חשוב לציין כי הגברה אינה מושלמת. האפשרות נשארת כי הגברה מוצלחת יכולה להציג שגיאות או יש הטיה כלפי loci ספציפי ב- DNA היעד. חשוב לקחת בחשבון את גודל הקטע הסופי של שיטות הגברה הגנום הזמינות. פיצול GenomePlex גורם לספריה עם שברים הנעים בין 200-500 bp, בעוד שערכת REPLI-g מייצרת שברים בגודל של כ- 10-20 kb. היישום המיועד במורד הזרם של פרוטוקול זה הוא FISH, ובכך להפוך את ערכת GenomePlex אפשרות אפשרית יותר, כפי שהוא סיפק את גודל הקטע הרצוי ואת היכולת לתייג שברי DNA ישירות דרך WGA. מולקולות דנ”א ארוכות המיוצרות על ידי הגברה REPLI-g חייב להיות מקוטע בתגובת תיוג ניק-תרגום במורד הזרם.
פרוטוקול זה הותאם כדי להגביר בהצלחה את הדנ”א מזרוע כרומוזום פוליטן אחת. פרוטוקולים אחרים דורשים איגום של שברי כרומוזום רבים (בדרך כלל 10-30) כדי להגביר בהצלחה את המדגם 7,11,28,40. למרות איגום של כרומוזומים מרובים אפשרי בשיטה שלנו, הסבירות המוגברת של זיהום מדגם מדגיש את החשיבות של תחילת הניסוי עם כמה שפחות כרומוזומים. אם כרומוזומי פוליטן אינם זמינים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לשימוש בכרומוזומים מיטוטיים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בריכה 10-15 כרומוזומים מיטוטיים לפני הגברה עבור דגים מוצלחים 11. הטיית הגברה נמוכה יותר עם כמויות גבוהות של DNA תבנית התחלתית 50. כרומוזומי פוליטן מספקים כ-512 עותקים של רצף דנ”א יחיד ו-1024 עותקים של שני רצפי דנ”א הומולוגיים. לכן, איגום כרומוזומים מיטוטיים יעזור להגדיל את האיכות הכוללת של מוצר DNA לאחר הגברה.
הליך זה יש שימושים פוטנציאליים רבים במחקרים ציטוגנטיים וגנומיים. כאן, השתמשנו בצבעי כרומוזום כדי לבסס את ההתאמה בין קטעים אוכרומטיים של זרועות פוליטן וכרומוזום מיטוטי ב An. gambiae. ניתן להחיל את אותן בדיקות ציור על אפיון ציטוגנטי של קווי התא של א. גמביה. סידורים גנומיים נרחבים ושינויים במספרי הכרומוזום הם מאפיינים נפוצים של קווי תאים 51,52. סידורים מחדש של כלנית, פוליפלוידיה וכרומוזומליים כגון טרנסלוקציות, היפוכים, מחיקות וכרומוזומי טבעת זוהו בשורות שונות של תאי יתושים 53,54. תצפיות ציטוגנטיות קלאסיות 55 ומיפוי פיזי 56 הדגימו את התרחשותן של טרנסלוקציות כרומוזומליות בזרוע כולה באבולוציה של יתושים מלריה. לכן, חומר microdissected יכול לשמש בשילוב עם ניסויים FISH להשוות הומולוגיה של אזורים כרומוזומליים בין מינים. ביצענו בהצלחה דגים תלת מימדיים עם הגשושית 2R-painting על כרומוזומי פוליטן בתאי אחות בשחלות הר שלם. שיטה זו תקל על המעקב אחר מסלולי כרומוזום וללמוד את הארכיטקטורה הגרעינית ב Anopheles. טכניקות כמו genotyping DNA 57,58, הדור הבא של רצף הגנום 26,27, פיתוח מפת פיזית וחיבור, ודור של בדיקות לציור כרומוזום 33,59 כל יכול להפיק תועלת זרוע באזור ספציפי microdissection. על ידי שילוב טכנולוגיית LCM וקידום WGA חד-תאי, אנו מדגימים שיטה יעילה ומעשית לייצור כמויות סבירות של דנ”א מזרוע כרומוזום פוליטנית אחת.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המענק של המכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור נ’ שרקוב
Acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | |
Membrane slides 1.0 PET | Zeiss | 415190-9051-000 | |
Buffer tablets “GURR” | Life Technologies | 10582-013 | |
KaryoMAX Giemsa Stain | Life Technologies | 10092-013 | |
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System | Abbott Molecular | 30-144110 | |
Vacufuge vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | |
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
Thermo Scientific NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | |
REPLI-g Single Cell Kit | Qiagen | 150343 | |
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) | Sigma-Aldrich | WGA4-10RXN | |
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) | Sigma-Aldrich | WGA3-50RXN | |
MZ6 Leica stereomicroscope | Leica | VA-OM-E194-354 | A different stereomicroscope can be used |
Olympus CX41 Phase Microscope | Olympus | CX41RF-5 | A different phase microscope can be used |
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope | Zeiss | ||
Thermomixer | Eppendorf | 22670000 | |
10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
50x Denhardt’s solution | Sigma-Aldrich | D2532 | |
99% Formamide | Fisher Scientific | BP227500 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D8906 | |
20x SSC buffer | Invitrogen | AM9765 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
DNA polymerase I | Fermentas | EP0041 | |
DNase I | Fermentas | EN0521 | |
Spermine | Sigma-Aldrich | S3256-1G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP3581 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E0396-25G | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-25G | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
AdhesiveCap 500 clear | Zeiss | 415190-9211-000 | |
QIAamp DNA Micro Kit (50) | Qiagen | 56304 | |
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4010 | |
37% Paraformaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 |