Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Şekil 2, protokol bölümleri 1-3 bir şemasını içerir. 1.. Atfs Yaratılış PCR ilgi konusu DNA bağlama alanını yükseltmek için primerler oluşturur. ACT1 promoter ve hormon reseptörüne homoloji (Şekiller 3 ve 4 'de tarif edildiği gibi) gerilme yMN15 içine doğru rekombinasyonu kolaylaştırmak için PCR ile ilave edilir. PCR, bir yüksek sadakat polimeraz kullanarak ilgi DBD yükseltmek. , Lityum asetat metodu kullanılarak 13 mayaya saflaştınlmış PCR ürünü> 1 ug dönüşümü. Mikrosantrifüjde 15 saniye boyunca en yüksek hızda dönüşüm, spin hücreleri aşağıdaki ve dönüşüm karışımı kaldırmak. YPD'de steril su ve plaka ~ 200 ul yeniden süspanse. Ertesi gün, YPD ikinci kopya plaka 5-FOA plakalar üzerine 13, (Cold Spring Harbor Maya Kılavuzunda tarif edildiği gibi 5-FOA plakaları yapılır). 2-4 d büyüme izinAYS, ve restreak en az 5-10 koloniler YPD'de üzerine. Dahil doğrulamak için Tablo 1 ve sırayla primerler kullanılarak bir koloni PCR gerçekleştirin. 2. ATF Plazmid Reporter Yaratılış (Literatürden gelmesi en muhtemel) ATF bağlama bölgesini belirler. (Gerekirse, ya Ultramers) Sipariş oligolardan gibi bağlayıcı bölgeyi istenen. Tablo 2'de gösterildiği gibi, Notl ve Xbal için doğru çıkıntılar ile üst ve alt iplikler olarak sipariş. Eşit molar konsantrasyonlarda (100 uM) için oligolar seyreltin. T4 polinükleotid kinaz ile bir PCR sonra tavlama işlemi kullanılarak fosforile. Reaksiyon koşulları Tablo 3'te bulunmaktadır. Digest 1-2 ~ 37 ° C (Tablo 4'te reaksiyon koşulları) 1 saat için HF-Notl ve Xbal ile pMN8 ug. Jel omurga bant arındırmak. 10 ng / ul saflaştırılmış omurga seyreltin. Çift sarmallı, fosforil seyreltinul başına omurgasının molar konsantrasyonunu 5x'e bağlanma yeri ated. T4 DNA ligazı kullanılarak, 30 dakika boyunca (Tablo 5), oda sıcaklığında sindirildi omurgasına bağlanma siteleri ligate. Transformasyon için, bir standart 50 ul, örneğin XL1-Blue ya da DH5-alfa, kimyasal olarak kompetan Escherichia coli için yarım ligasyon reaksiyonu ekleyin. Daha sonra, bir ısı şoku 42 ° C su banyosu içinde 45 saniye için hücre ve 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Dönüşüm reaksiyonuna SOC ortamı içinde 900 ul ekleyin. Bir silindir tambur üzerinde, 1 saat boyunca 37 ° C'de büyür. LB + amp (100 ug / ml) plaka başına 100-200 ul hücre yayıldı ve bir gece boyunca inkübe edilir. E. büyümek LB + amp içerisinde coli sıvı ve hasat plazmid DNA. Seri primeri 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 'kullanılarak ligasyon koloniler yeni raportör plazmid olun. ATF-içeren maya str yeni bir raportör plazmid Dönüşümülityum asetat dönüşümünü kullanarak Bölüm 1 ain. 3. GFP Reporter kullanarak Gen İfade ATF İndüksiyonunun etkisini ölçmek Örneklerinin hazırlanması: 25 mM β-estradiol stok (β-estradiyol etanol + 0,0681 g 10 mi) olun. Buzdolabında tutun. ATF + 5ml SC-URA gecede gerginlik Reporter içeren büyütün. Elde dokuz 250 ml şişeler sallamak ve her 25 ml SC-URA ekleyin. 0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM veya 10 uM β-estradiol ekleyin. Bu, en kolay şekilde, 25 mM β-estradiyol stoklar 10-kat seri dilüsyonları yaparak yapılır. 10 uM β-östradiolün bir son konsantrasyon için, SC-URA 25 ml için 25 mM β-estradiyol stoklar 10 ul ekle. Şişelere (1:200 seyreltme) ile gece boyunca kültürler 125 ul ekleyin. 2 kalan şişelere, bir konstitütif GFP üreten Strai ile inokülen ve GFP yoksun bir gerginlik. Bu akış sitometresi kalibre edilmesi için ihtiyaç vardır. 12-18 saat boyunca 30 ° C'de 200 rpm'de çalkalanır. Not: Optimal inkübasyon süresi GFP indüksiyon artık değişiklik β-estradiyol ilave edildikten sonra zaman belirlenmesi ile belirlenir. Her kültürün 500 ul alır ve ayrı 1.7 ml mikrosantrifüj tüpler aşağı spin. Aspire SC-URA. 1 ml PBS +% 0.1 Tween-20 ve aspirasyon kez yıkayın. PBS +% 0.1 Tween-20 ve tekrar süspansiyon 1 ml ilave edilir. Falcon tüplerine PBS +% 0.1 Tween-20 içinde 1 ml ilave edilir. 5 ml tüpler (son hacim = 2 mi) ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ekleyin (birkaç gün boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir). İsteğe bağlı: dağılmasından hafifçe sonicate hücreler, herhangi clumped hücreleri. Akış sitometri analizi: Genel Bakış: 10.000-100.000 hücrelerinin floresan tipik haliyle numune başına analiz edilir. Veri FlowJo veya MATLAB özel komut dosyalarını kullanarak ya da işlenebilirR. GFP pozitif ve negatif kontrolleri kullanarak GFP kanalın voltajı kalibre emin olun. FCS içerik dışa sonra, bu fonksiyon fca_readfcs (birlikte Şekil 6'da tek bir komut http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) işlemek için kullanılabilir Veri. Akım sitometri gerçekleştirin. Maya hücreleri tanımlamak için kullanın ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC). ~ 3,000 hücre / sn akış hızını ayarlayın. GFP (FITC kanal) ölçün. Veriler toplandığında, ihracat. FCS dosyaları MATLAB yükleyin. . FCS dosyaları fcs_readfcs.m, ve Şekil 6, aynı klasöre edilene benzer bir komut dosyası taşıyın. Veri ve komut dosyalarını içeren klasörü mevcut çalışma dizini değiştirin. (Not Şekil 6 komut dosyasını çalıştırın:efsane elle) Şekil 7'de görüldüğü neler üretmek için girildi. 4. Hücre Büyüme ATF İndüksiyonunun etkisini ölçmek Dondurulmuş stokları, hem dışarı çizgi (1) ayrı YPD plakalar üzerine bir ATF içeren suşu (örneğin yMN15 olarak) (2) bir ATF-eksik suşu. Büyüme 2 gün sonra, her bir suş ile YPD sıvı ihtiva eden ayrı bir 5 ml kültür tüpleri inoküle ve 30 ° C de bir gece boyunca büyümeye 10-kat% 100 etanol içinde 10.000 kat (0.025 uM β-estradiyol) bir 0.25 mM β-estradiyol stok çözelti seri seyreltmeleri yapın. YPD sıvı (1-250 seyreltme) 10 ml gece boyunca kültürler 40 ul ekle. Ve her bir suş için, 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına 18 seyreltilmiş 96 ul hücre ilave edin. Hücrelere β-estradiyol 4 ul ekleyin. Önemli bir nokta, her kuyu toplam etanol aynı miktarda emin olmaktır. (Alternatif olarak, mo β-estradiyol konsantre stok kullanılmış ve daha sonra noktasına seyreltilebilir yeniden büyümesi üzerindeki etkisi, etanol içinde) ölçülebilir değildir. Üç kez yapın. Her bir suş için kuyu üç etanol okunur kontrol olmalıdır. Gaz geçirgen bir zarın içinde 96 oyuklu plaka örtün. Plaka okuyucu büyüme (OD 600) izleyin. Gibi maksimum eğim bulgu olarak standart yöntemlerin herhangi biri kullanılarak büyüme oranlarını ölçmek. Not: R programlama ortamında çalışır açık kaynak yazılım paketi grofit 14 ile iyi bir başarı elde ettik Bu söz değer olduğunu 96-plaka deneyleri hesaplanan büyüme oranları (25 ml kültür)-şişeleri sallamak göre ise. ille (nedeniyle fizyolojisi ve enstrümantasyon hem de farklılıklar), biz (bu her zaman böyle olmayabilir ama) göreceli büyüme oranları benzer olduğunu tespit ettik aynı. tle "> 5. Başlatılabilen Genomik alellerin oluşturun PMN10, (zıt oryantasyonda) KanMX kaynaşmış pMN8 arasındaki ATF-duyarlı promoteri ile bir noncentromeric plazmid elde edilir. Kısıtlama, Bölüm 2'deki gibi vektör omurgası ve jel özü sindirimi. Tavlama, fosforile ve Bölüm 2'de tarif edildiği gibi uygun bir bağlama siteleri içeren ligate oligolar. Dizisi doğrulayın. Bu durumda plazmit, uyarılabilir alel yaratmak için, bir DNA şablonu olarak hizmet edecektir. Ilgi konusu karşılık gelen ATF ifade eden maya suşu elde edilir. PCR Tablo 6 primerleri kullanılarak KanMX-Promoter kaseti (~ 2 kb) yükseltmek. , Lityum asetat metodu kullanılarak ATF-ifade suşu içine PCR ürünü dönüşümü. YPD'de + G418 ertesi gün üzerine YPD'de ve çoğaltma plaka üzerinde plaka. Inci ileri primeri (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') ve ters primer iç kullanılarak promotörün uygun ekleme teyitolan promoter gen e değiştirilmiştir. Ters primer genellikle ilk ATG 15 bp alt akışında 200-300 arasında olacak şekilde tasarlanmıştır. Nihai PCR ürünü, ~ 1.2 kb'dir.