迅速な合成およびGFPベースの記者との化学的に活性化する転写因子のスクリーニング

図2は、プロトコルのセクション1-3の模式図を提供しています。 1。 ATFSの作成 PCRは、目的のDNA結合ドメインを増幅するためのプライマーを作成する。 ACT1プロモーターおよびホルモン受容体に対する相同性は、（ 図3および4に記載されるように）株yMN15に正しい組換えを容易にするために、PCRを介して添加される。 PCRは、高忠実度ポリメラーゼを用いて、目的のDBDを増幅する。 酢酸リチウム法13を用いて、酵母に精製されたPCR産物の> 1μgのを変換する。 形質転換後、微量15秒間最高速度で細胞をスピンし、変換ミックスを削除します。 YPDに滅菌水、プレートの〜200μl中に再懸濁します。 5-FOAプレート上に、YPDから翌日、レプリカプレート（コールド·スプリング·ハーバー酵母マニュアルに記載されているよう5-FOAプレートが作られる）13。 2-4日間増殖を可能にAYS、およびYPD上に、少なくとも5〜10個のコロニーをrestreak。含めることを確認するために、 表1およびシーケンスのプライマーを用いてコロニーPCRを行う。 2。 ATFプラスミドレポーターの作成 （文献から来る可能性が最も高い）のATFの結合部位を決定します。 （必要に応じて、またはUltramers）順番はオリゴとして結合領域を希望する。 表2に示すようにNotI＆XbaIでの正しいオーバーハングを有する上部と下部の鎖のように注文。 等モル濃度（100μM）にオリゴを希釈します。 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化して、サーモサイクラー中でアニール。反応条件を表3に示す 。 37℃（ 表4の反応条件）で1時間のNotI-HF＆XbaIでpMN8のダイジェスト〜1〜2μgの。 ゲルは、バックボーンバンドを精製する。 10 NG /μlに精製されたバックボーンを希釈します。 二本鎖、ホスホリルを希釈μLあたりの背骨のモル濃度を5倍の結合部位をated。 T4 DNAリガーゼを用いて、30分間（ 表5）を、室温で消化し ​​た骨格への結合部位を連結する。 形質転換のために、標準の50μL、このようなXL1-ブルーまたはDH5アルファなどの化学的にコンピテントな大腸菌に半分ライゲーション反応を追加します。 次いで、熱ショック42℃の水浴中で45秒間細胞および2分間氷上に置く。 形質転換反応にSOC培地900μLを加える。 ローラードラム上で1時間37℃で成長する。 LB + AMP（100μg/ ml）をプレート当たり100〜200μlの細胞を広げ、一晩インキュベートする。 E.育つ LB + AMPでの大腸菌の液体や収穫プラスミドDNA。シーケンスは、プライマー5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 'を使用してライゲーションコロニーから新しいレポータープラスミドを確認します。 ATF含有酵母STRに新しいレポータープラスミドを変換酢酸リチウム形質転換を用いて第1のアイン。 3。 GFPレポーターを用いた遺伝子発現にATF誘導の影響を定量化サンプルを調製する。 25 mMのβ-エストラジオールの在庫（β-エストラジオールのエタノール+ 0.0681グラムの10ミリリットル）を作る。冷蔵保管してください。 5ミリリットルのSC-URA内のATF +レポーター含有ひずみ一夜を育てる。 入手9 250ミリリットルのフラスコを振るし、それぞれに25ミリリットルのSC-URAを追加します。 0 nMで、0.1 nMで、1 nMで、10 nMで、100nmであり、1μM、または10μMのβ-エストラジオールを追加します。これは、最も容易に25mMのβ-エストラジオールストックの10倍連続希釈を作製することによって行われる。 β-エストラジオール、10μMの最終濃度のため、SC-URAの25ミリリットルに25 mMのβ-エストラジオールの株式の10μlを加える。 フラスコ（1:200希釈）を一晩培養物の125μLを加える。 2残りのフラスコのために、構成的にGFP産straiで接種Nと、GFPを欠損株。これらは、フローサイトメータを較正するために必要とされる。 12月18日時間30℃、200rpmで振とうする。 注：最適なインキュベーション時間は、GFPの誘導もはや変化がβ-エストラジオールの添加の後に時識別することによって決定される。 各培養液500μlを取り、別の1.7ミリリットルの微量遠心チューブにスピンダウン。 吸引SC-URA。 1ミリリットルのPBS +0.1％のTween-20および吸引に一度洗う。 PBS +0.1％のTween-20および再懸濁の1ミリリットルを追加します。 ファルコンチューブにPBS +0.1％のTween-20の1ミリリットルを追加します。 5ミリリットルのチューブ（最終容量= 2ml）中に再懸濁した細胞を追加する（数日間4℃で保存することができる）。 オプション：崩壊へ軽く超音波処理細胞任意の凝集細胞。 フローサイトメトリー分析：概要：10,000〜100,000細胞の蛍光は、一般的に、サンプルごとに分析する。データは、FlowJoソフトやMATLABでカスタムスクリプトを使用するかのどちらかに処理することができるR.は、GFP陽性および陰性コントロールを使用して、GFPチャネルの電圧を校正してください。 FCSファイルがエクスポートされると、このような機能fca_readfcsと一緒に、図6の1（としてスクリプトhttp://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-readerは ）処理するために使用することができますデータ。 フローサイトメトリーを実行します。 酵母細胞を同定するために使用する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）。 〜3000セル/秒に流量を設定。 GFP（FITCチャネル）を測定します。 データが収集されると、輸出。、FCSファイル MATLABをロードします。 。FCSファイル、fcs_readfcs.m、 図6と同じフォルダにそのようなスクリプトを移動します。 データとスクリプトを含むフォルダに現在の作業ディレクトリを変更します。 注意します（ 図6からスクリプトを実行します。伝説は手動で）、図7に見ているものが生成するために入力されています。 4。細胞増殖に対するATFの誘導の影響を定量化凍結ストックから、独立したYPDプレートの上に（1）ATF-含む株と（例えばyMN15など）（2）ATF-欠損株両方で連勝。 成長の2日後に、各菌株をYPD液体の5ミリリットルを含む別培養管に接種し、30℃で一晩増殖 100％エタノール中で10,000倍に0.25 mMのβ-エストラジオールの原液アップ（0.025100μMのβ-エストラジオール）の10倍連続希釈を行う。 YPD液体（1〜250希釈）10mlに一晩培養液40μlを追加します。 それぞれの株については、96ウェルプレートの18ウェルに希釈した細胞の96μlを加える。 細胞にβ-エストラジオールの4を添加する。重要な点は、各ウェルは、総エタノールと同じ量を持っていることを確認することです。 （代わりに、MO β-エストラジオールの濃縮ストックを使用し、その後ポイントに希釈することができる再増殖に対するエタノールの影響）は測定できない。 三重で行う。各菌株のための井戸の三つは、エタノールのみのコントロールである必要があります。 ガス透過性膜96ウェルプレートを覆う。 プレートリーダーの成長（OD 600）を監視します。 このような最大勾配を求めるなどの標準的な任意の数の方法を用いて成長速度を定量化する。 注：私たちは、Rプログラミング環境で実行されるオープンソースソフトウェアパッケージgrofit 14、との良好な成功を持っていたことが言及する価値があることを96ウェルプレートアッセイから計算された成長率は（25ミリリットル文化） -振盪フラスコと比較しながら。 （原因生理学および計測の両方の違い）、我々は（これは必ずしもそうでないかもしれないが）の相対成長率が類似していることを観察してきた、必ずしも同じではありません。 TLE "> 5。誘導ゲノム対立遺伝子を作成します。 pMN10、（反対方向に）KanMXに融合しpMN8からATF-応答性プロモーターとnoncentromericプラスミドを得。 制限は、第2節のように、ベクター骨格およびゲル抽出を消化。 アニール、リン酸化、および第2章で説明したように、適切な結合部位を含むライゲーションオリゴ。 シーケンスが確認します。このプラスミドは、今や誘導性対立遺伝子を作成するためのDNAテンプレートとして機能する。 興味のある対応ATFを発現する酵母株を取得。 PCRは、 表6からのプライマーを用いて、KanMX-プロモーターカセット（〜2キロバイト）を増幅。 酢酸リチウム法を用いて、ATF-発現株へのPCR産物を変換します。 YPD + G418へYPDとレプリカプレート上のプレートの翌日。 フォワードプライマー（5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 '）および第内部のリバースプライマーを用いて、プロモーターの適切な挿入を確認その電子プロモーター遺伝子が置換されている。リバースプライマーは、典型的には、第一ATG 15の下流200-300 bpの間になるように設計されている。最終的なPCR産物を〜1.2 KBです。