Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Figuur 2 geeft een schematische weergave van protocol secties 1-3. 1. Creatie van ATFs Maak primers voor PCR amplificeren DNA-bindende domein van belang. Homologie de ACT1 promotor en hormoonreceptor (zoals beschreven in de figuren 3 en 4) wordt toegevoegd via PCR correcte recombinatie in de stam yMN15 vergemakkelijken. PCR versterken DBD van belang met behulp van een high fidelity polymerase. Transformeren> 1 ug gezuiverd PCR product in gist met de lithiumacetaat werkwijze 13. Na transformatie, spin-cellen op topsnelheid gedurende 15 sec in microcentrifuge en verwijder transformatie mix. Resuspendeer in ~ 200 pi steriel water en plaat op YPD. De volgende dag replica plaat uit YPD op 5-FOA-platen (5-FOA platen zijn zoals beschreven in de Cold Spring Harbor Gist Manual) 13. Laat groei voor 2-4 degen, en restreak minstens 5-10 kolonies op YPD. Voer een kolonie PCR met de primers in Tabel 1 en sequentie integratie verifiëren. 2. Creatie van ATF plasmide Reporter Bepaal de bindingsplaats van de ATF (meest waarschijnlijk uit de literatuur). Bestel de gewenste binding regio als oligo (of Ultramers, indien nodig). Bestel onderwerp en onderstrengen correcte overhangen voor NotI en XbaI zoals getoond in Tabel 2. Verdun oligo equimolaire concentraties (100 uM). Fosforyleren met T4 Polynucleotide Kinase en vervolgens gloeien in een thermocycler. De reactieomstandigheden zijn in Tabel 3. Digest ~ 1-2 ug pMN8 met Notl-HF en Xbal gedurende 1 uur bij 37 ° C (reactieomstandigheden in tabel 4). Gel zuiveren de ruggengraat band. Verdun het gezuiverde ruggengraat van 10 ng / ul. Verdun de double-stranded, fosforylated bindingsplaats aan de molaire concentratie van backbone 5x per pl. Met T4 DNA Ligase, ligeren de bindingsplaatsen in de hoofdketen gedigereerd bij kamertemperatuur gedurende 30 min (tabel 5). Voor transformatie voeg halve ligatiereactie 50 gl standaard chemisch competente Escherichia coli zoals XL1-Blue of DH5-alfa. Heat shock cellen gedurende 45 seconden in een 42 ° C waterbad en plaats op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 900 ul van SOC medium tot transformatie reactie. Groeien bij 37 ° C gedurende 1 uur op een roller trommel. Verspreid 100-200 pi cellen per LB + AMP (100 ug / ml) plaat en incubeer overnacht. Grow up E. coli in LB + AMP vloeistof en oogst plasmide-DNA. Sequence controleren nieuwe reporter plasmide uit ligatie kolonies met behulp van de primer 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '. Transformeren nieuwe reporter plasmide in-ATF die gist bevatten strain van afdeling 1 gebruik lithiumacetaat transformatie. 3. Kwantificeren van de Effect van ATF Inductie op genexpressie met behulp van GFP Reporter Voorbereiding van de monsters: Maak 25 mM β-estradiol voorraad (10 ml ethanol + 0,0681 g β-estradiol). Koel bewaren. Groeien ATF + Reporter-bevattende stam overnacht in 5 ml SC-URA. Verkrijgen negen 250 ml schud kolven en voeg 25 ml SC-URA aan elk. Voeg 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM of 10 pM β-oestradiol. Dit is het gemakkelijkst door het maken van 10-voudige seriële verdunningen van de 25 mM β-estradiol voorraad. Voor een uiteindelijke concentratie van 10 uM β-oestradiol, voeg 10 ul van de 25 mM β-oestradiol voorraad 25 ml SC-URA. Voeg 125 ul van overnachtcultures op flesjes (1:200 verdunning). Voor de 2 resterende kolven, te enten met een constitutieve GFP producerende strain en een stam ontbreekt GFP. Deze zijn nodig voor het kalibreren van de stroom cytometer. Schudden bij 200 rpm bij 30 ° C gedurende 12-18 uur. Opmerking: De optimale incubatietijd wordt bepaald door het identificeren wanneer GFP inductie niet meer verandert na toevoeging van β-oestradiol. Neem 500 pi van elke cultuur en spin down in afzonderlijke 1,7 ml microcentrifugebuisjes. Aspireren SC-URA. Was eenmaal in 1 ml PBS +0,1% Tween-20 en aspireren. Voeg 1 ml PBS +0,1% Tween-20 en resuspendeer. Voeg 1 ml PBS +0,1% Tween-20 Falcon buizen. Voeg de geresuspendeerde cellen 5 ml buisjes (eindvolume = 2 ml) (kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele dagen). Optioneel: ultrasone trillingen cellen te lichtvaardig verbreken elke samengeklonterd cellen. Flowcytometrieanalyse: Overzicht: De fluorescentie van 10.000-100.000 cellen wordt meestal geanalyseerd per monster. Gegevens kunnen in FlowJo of met behulp van aangepaste scripts in MATLAB of verwerkt wordenR. Zorg ervoor dat spanning van de GFP kanaal kalibreren met GFP positieve en negatieve controles. Zodra de FCS bestanden zijn uitgevoerd, een script, zoals die in figuur 6 samen met de functie fca_readfcs ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader kunnen) worden gebruikt voor het verwerken van de gegevens. Voer flowcytometrie. Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) om gistcellen te identificeren. Stel het debiet te ~ 3000 cellen / sec. Meet GFP (FITC kanaal). Zodra de gegevens zijn verzameld, de export. FCS bestanden Laad MATLAB. Verplaats de. FCS bestanden, fcs_readfcs.m, en een script vergelijkbaar met die van figuur 6, naar dezelfde map. Verander de huidige werkmap naar de map met de gegevens en scripts. Voer het script uit figuur 6 (let op: delegende is handmatig ingevoerd om te produceren wat zien in figuur 7). 4. Kwantificeren van de Effect van ATF Inductie op celgroei Uit bevroren voorraden, streak uit zowel (1) een-ATF met stam en (2) een-ATF ontbreekt stam (zoals yMN15) op aparte YPD platen. Na 2 dagen van groei, te enten aparte cultuur buisjes met 5 ml YPD vloeistof met elke stam en groeien 's nachts bij 30 ° C. Voer 10-voudige seriële verdunningen van een 0,25 mM β-oestradiol voorraadoplossing tot 10.000-voudig (0,025 uM β-oestradiol) in 100% ethanol. Voeg 40 ul van 's nachts culturen tot 10 ml YPD vloeistof (1-250 verdunning). Voor elke stam, voeg 96 ul verdunde cellen aan 18 putjes van een 96-wells plaat. Voeg 4 ul van β-oestradiol aan de cellen. Een essentieel punt is om ervoor te zorgen dat elk putje heeft dezelfde totale hoeveelheid ethanol. (U kunt ook een mo re geconcentreerde voorraadoplossing van β-oestradiol kunnen worden en vervolgens verdund tot het punt het effect van ethanol op de groei niet meetbaar). Voer in drievoud. Drie van de putjes voor elke stam moet alleen ethanol-controles. Bedek de plaat met 96 putjes gas permeabel membraan. Monitor groei (OD 600) in plaat-lezer. Kwantificeer de groei met behulp van een aantal standaard werkwijzen zoals het vinden van de maximale helling. Opmerking: We hebben goed succes met het open source softwarepakket Grofit 14, die in de R programmeeromgeving loopt gehad Het is vermeldenswaard dat, terwijl de groeipercentages berekend op basis van 96-well plaat assays in vergelijking met (25 ml culturen)-flessen te schudden. zijn niet noodzakelijk (zowel door verschillen in fysiologie en instrumentatie) hebben waargenomen dat de relatieve groeisnelheid vergelijkbaar (hoewel dit niet altijd het geval kan zijn). TLE "> 5. Maak Inducible Genomic Allelen Verkrijgen pMN10, een noncentromeric plasmide met de ATF-responsieve promotor uit pMN8 gefuseerd met KanMX (in tegengestelde richting). Restrictiedigest de vector backbone en gel extract zoals in deel 2. Gloeien, fosforylering en ligeren oligo's die geschikte bindingsplaatsen zoals beschreven in paragraaf 2. Sequence controleren. Dit plasmide zal nu dienen als een DNA-matrijs voor het maken van de induceerbare allel. Het verkrijgen van de giststam de uiting van de overeenkomstige ATF van belang. PCR amplificeren van de KanMX-promotor cassette (~ 2 kb) met primers van tabel 6. Transformeer het PCR product in de ATF-expressie stam volgens de lithiumacetaat werkwijze. Plaat op YPD en replica plaat op YPD + G418 de volgende dag. Bevestig geschikte insertie van de promotor met de voorwaartse primer (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') en een reverse primer interne ee gen waarvan de promoter is vervangen. De reverse primer is meestal ontworpen op tussen 200-300 bp stroomafwaarts van het eerste ATG 15. Het uiteindelijke PCR product is ~ 1,2 kb.