Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması
Summary
Birincil invaziv kadavradan mesane kanseri zenograftlarını aşılamak için kurulan teknik laparotomi ve mesane seferberlik gerektirir. Bu prosedür, fareler üzerinde önemli morbidite uğratan teknik açıdan zor ve zaman alıcıdır. Bu nedenle perkütan yaklaşım ultrason rehberlik kullanarak, yüksek hassasiyet geliştirdi.
Abstract
Ortotopik mesane kanseri ksenograftları in vivo moleküler, hücresel manipülasyonlar ve yeni tedavi ajanları araştırmak için altın standarttır. Uygun hücre hatları intravezikal damlatma (kasa invaziv olmayan büyüme model) ya da mesane duvara içi enjeksiyon ile (invaziv büyüme model) ile aşılanır. Her iki prosedür, karmaşık ve oldukça zaman alıcıdır. Ayrıca, yüzeysel modeli tümörijenik şu instilasyon olan hücre hatları eksikliği nedeniyle eksiklikleri vardır. İçi enjeksiyonu, diğer taraftan, prosedürün invaziv ve ana fare için ilişkili morbidite nedeniyle zor edilir.
Akılda bu eksiklikleri ile, biz kadavradan mesane kanseri zenograftlarını oluşturmak için minimal invaziv bir yaklaşım geliştirmek için önceki yöntemleri değiştirilmiş. Ultrason eşliğinde başarıyla mesane kanseri hücre hatları UM-UC1, UM-UC3 ve UM-perkütan aşılama gerçekleştirdik50 atimik çıplak içine UC13. Biz bu yaklaşımı, etkili, kesin ve güvenli bir zaman olduğunu göstermek mümkün olmuştur. Bu teknik ile, ilk olarak bir boşluk PBS ile mesane mukoza altında oluşturulur, ve tümör hücreleri, daha sonra ikinci bir aşamada bu alana enjekte edilir. Tümör büyümesi, biyolüminesans görüntüleme ve ultrason ile düzenli aralıklarla izlenir. Ortalama tümör hacimleri çalışma süresi boyunca bizim 50 farelerin biri ama tüm giderek artmıştır.
Bizim kurum olarak, minimal invaziv, hızlı ve son derece hassas bir şekilde mesane kanseri ksenogref aşılanmasını sağlayan bu yeni yaklaşım, geleneksel modeli yerini aldı.
Introduction
Kanser araştırma tümör biyolojisi anlayışımızı derinleştirmek amacıyla hasta tümörlerden türetilmiş hücre hatları kullanılarak, insan kanserinin hayvan modellerinde bağlıdır. Farklı tedavi stratejileri çerçevesinde canlılarda büyüme analizi için, sıçan kadavradan mesane kanseri modelleri referans standardı 1,2 kalır. Bağışıklığı baskılanmış farelerin (ksenogref modeli) insan mesane kanser hücrelerinin aşılama intravezikal damlatılması üzerinde mesane duvarına ("intravezikal modeli") 3,4,5 veya direkt enjeksiyon ("intramural model") 6,7 dayanır. Her iki teknik de sıçanlarda 8,9 yapılabilir.
Intravezikal sonra yeni tedavi maddeleri daha sonra intravezikal damlatılması için uygun olan mesane ürotelyal yüzeyinde tümörlerin oluşumuna neden olmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntem ile verildiği zaman güvenilir olan tümörijenik hücre çizgilerinin sayısının sınırlı olduğud Bu hücre hatları, KU7 biri, son zamanlarda HeLa 4,10 olduğu gösterilmiştir. Intravezikal de zaman nedeniyle gerekli kalma kere alıcıdır ve bu sık sık idrar, üreter ve renal pelvis 11 dahil olmak üzere, üriner sistem bitişik elemanlar, tümör büyümesini uyarmaktadır. Ayrıca, instillasyon genellikle üreterler mesane girin mesane katında tümör büyümesine yol açar, ve bu üst üriner sistem tıkanıklığı ve eşlik eden böbrek yetmezliğine neden olabilir.
Sistemik tedaviler için uygun olan birincil invaziv mesane kanseri ksenograftları mesane duvarı 12 içine, tümör hücrelerinin direkt enjeksiyonu ile oluşturulur. Çok sayıda hücre çizgileri, bu modelde, yeterli büyümeye rağmen, herhangi bir sınırlamaya insizyon 13 için ihtiyaç ilişkin modelin invaziv olan. Modeli nedeniyle de hassas kas duvara hücreler enjekte teknik zorluk öğrenmek için zordurmesane.
Farelerde ortotopik primer invaziv mesane kanseri zenograftlarını kurmak için yeni bir yaklaşım "intramural modeli" varolan eksikliklerin giderilmesi amacıyla kliniğimizde geliştirilmiştir. Biz başarıyla kurulmuş invaziv modelini değiştirmek için bu yeni tekniğin sonuçlanan ön mesane duvarına mesane kanseri hücrelerinin perkütan, ultrason rehberliğinde enjeksiyon optimize başardık. Ayrıca, biz potansiyel "intramural modeli" doğruluk ve tekrarlanabilirlik gelişmiş var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser tedavisinde hemen hemen tüm büyük gelişmeler klinik deneyler başlamadan önce, hayvan modellerinde test gerektirir. Kanser hayvan modelleri ve in vivo tümör biyolojisi okumak için araştırmacılar sağlayacak gerekli araçlardır. Ortotopik ksenogref modelleri 1,2 altın standart kalır ve (hücre hatlarının seçimi açısından) en esneklik sunuyor ve en pratik yarar var devam ediyor.
Gösterilen prosedür doğrultusunda% 100 bir teknik başarı oranı ile üç farklı hücre çizgilerinin ultrason eşliğinde yapılan enjeksiyon ile ksenograft tümörlerinin önceden belirlenmiş gönder US et al. 12 tarafından tarif edilen ortotopik bir model bir minimal invaziv bir modifikasyonudur. Sürekli izlem sırasında, farelerin% 98 tümör hacminde sürekli bir artış göstermiştir.
Minimal invaziv tekniği yaparak biz intramural modelin mevcut sınırlamaları ele başardık. Respe yanındahayvan refahı cting, bu prosedürün azaltılmış invazivliği da cerrahi komplikasyonların sayısını azaltarak in vivo deneylerin tekrarlanabilirliği katkıda bulunmaktadır. Oldukça abdominal laparotomi ve yara kapatılması için ilgili gereksinimini önlemek için etkili zaman. Biz (1.6 ±) 3.4 dk önemli hayvan başına işlem süresini azaltmak için başardık. Ancak, bizim yeni yaklaşımın baş avantajı doğruluğu. Yüksek çözünürlüklü ultrason bize mesane duvarının mukozasının altında tuzlu enjeksiyon yarattığı boşluk görüntülemenizi sağlar. Bu enjeksiyon, bir ilk adım, ikinci bir aşamada, tümör hücre enjeksiyonu kolaylaştırır ve tümör hücre dökülme riskini en aza indirir. Bu iğne yerleştirme görselleştirmek mümkün değildir ve enjeksiyon tam derinliği ilişkin belirsizlik unsuru her zaman vardır laparotomi sonra içi enjeksiyon tekniği ile tezat. Ayrıca, katı ön duvara mesane tümör hücrelerinin aşılanmasını olarak, tümör Büyümeposterior mesane duvarına h önlenir. Daha sonra üreter deliklerinin yakınında tümör büyüme nedeniyle obstrüktif komplikasyon oranı son derece nadirdir. Bu Ekteki etkisi daha uzun büyüme ve tedavi süreleri sağlar.
Ultrason eşliğinde tümör aşılama ana sınırlama yeterli teknik donanım için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu prosedürün performans olası insan kanserinin hayvan modellerinde uzmanlaşmış merkezlerine sınırlandırılacaktır. Bu, yeni bir hayvan modelleme uzmanlığı ile bu kurum ve grupların dışında araştırma grupları arasında işbirliğini teşvik etmelidir.
Ultrason görüntüleme ve bazı el becerisi ile aşinalık bağımlı olmasına rağmen, bu model yetkili talimat altında öğrenmek kolaydır. Prosedüründe önemli bir adım tuzlu su ile mesane duvarı yapay bir uzay submukozal yaratılmasıdır. Bu uzay perforasyon o olmadan oluşturulduktan sonramukoza tabakası f, birkaç dakika boyunca sabit kalır. Tümör hücrelerini aşılamak için bu boşluk içine ikinci bir iğne kılavuz oldukça basittir. Submukozal alanın oluşturulması sırasında ana komplikasyon mesane lümenine iğne perforasyonudur. Submukozal alanı yaratılması, ancak hala mümkün. İğne mesane duvarı içine yavaş yavaş geri gereken ve tuzlu mukoza tabakası iğnenin ucu üzerinde döndürür sadece zaman enjekte edilir. Bu manevra sonra, submukozal alan daha az kararlı olduğunu (tuzlu su, 30-60 saniye içinde mesane lümenine dışarı çıkar) ve tümör hücrelerinin enjeksiyonu hızlı bir şekilde yapılması gerekir. Mesane lümenine tümör hücrelerinin dökülme mukoza delinmesi ile bu gibi durumlarda ortaya çıkabilir. Intramural uzaydan tümör hücrelerinin kaybı takibinde azalan tümör hacmine yol olsa da, herhangi bir intravezikal tümör alımını gözlenmiştir hiç.
Başka potansiyel complication enjeksiyon kanalı boyunca periton boşluğuna tümör hücrelerinin dökülme olan. Bu 50 hayvanlarda, sadece bir intraperitoneal tümör hücresi yayılmasını görülmektedir ve bu ilk girişimleri birinde meydana geldi. Biz, çok büyük bir tümör hücresi süspansiyonu hacminin enjeksiyon için bu özellik. Bu 50-40 ul gelen hacmini azaltarak başka periton dökülmesine neden olduğu gerçeği ile desteklenmiştir.
Kemirgen kadavradan mesane kanseri xenograftlarının Bu minimal invaziv aşılama eşit araştırmacı ve hayvanları hem de yararlanarak, mevcut "intramural modeli" yenilikçi bir modifikasyonunu temsil eder. Bu modelin avantajı, böyle bir minimal invazif şekilde ortotopik yabancı doku nakli yapılan tümör oluşturmak amacıyla, böbrek, prostat, karaciğer gibi diğer organlara adaptasyonunun ediyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, küçük hayvan ultrason görüntüleme platformu kullanımı konusundaki talimatlar için tümör hücre hatları ve Ben deeley viral iletimini gerçekleştirmek için Eliana Beraldi kabul etmek istiyorum.
Bu proje Alman Vakfı Sistemi tarafından desteklenmiştir (DFG; JA 2117/1-1: 1), Kanada Kanser Topluluğu Araştırma Enstitüsü ve Vancouver Kıyı Sağlığı Araştırma Enstitüsü'nden bir mentored Hekim Bilimci Ödülü. Ultrason görüntüleme platformu Yenilik Kanada Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
References
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
