Floem sap bileşimi yanı sıra yükleme ve uzun mesafe taşıma mekanizmasının Bilgi bitki gelişimi ve stres / patojen yanıt olarak ve ulaşım asimile uzun mesafe sinyal anlaşılması için gereklidir. Bu el yazması EDTA-kolaylaştırdı yöntemi kullanılarak floem eksuda toplanması açıklar.
Bitki floem uzun mesafe taşımacılığı (fotoğraf-) ve biyotik veya abiyotik stres taşıma sinyallerinin olarak özümseyen için gereklidir. Bu şekerler, amino asitler, proteinler, RNA, lipid ve diğer metabolitleri içerir. Böylece kompozisyonu ve fonksiyon floem ki, bu moleküllerin birçok rolü ve anlamada büyük bir ilgi varken, bitki gelişimi ve stres önemleri yanıt belirlenecek henüz. Floem analizi için bir engel üzerine floem mühürler kendisini yaraladı gerçeği yatıyor. Sonuç olarak, floem sap elde edilebileceği bitkilerin sayısı sınırlıdır. Eklendi ekipman olmadan çeşitli bitki türlerinden floem eksuda toplanması sağlayan bir yöntem EDTA-kolaylaştırdı floem eksuda koleksiyonu burada açıklanan olduğunu. Kullanımı kolay iken, hücrelerin yaralama yol yapar ve bakım hasarlı hücrelerin, içeriği kaldırmak için alınması gereken. Buna ek olarak, çok sayıda kontrol eksüda saflığı kanıtlamakgereklidir. Oldukça içeriğini sadece göreceli miktar oluşabilir floem sap (birçok türde mümkün değil) doğrudan bir koleksiyon daha bir sızma olduğu için. Diğerleri üzerinde bu yöntemin avantajı birçok otsu veya odunsu bitki türlerinin (Perilla, Arabidopsis, kavak, vb) kullanılan ve minimal ekipman ve eğitim gerektirir olmasıdır. Bu proteinler, şekerler, lipitler, RNA virüsleri ve metabolitlerin sonraki analiz için kullanılabilir dışkılarının oldukça büyük bir miktarda yol açar. Bu, hem araştırma hem de bir öğretim laboratuarda kullanılabilir kadar basittir.
Bitkiler olumsuz koşullar kaçmak için hareket edemez. Sonuç olarak, onlar, çevresel streslere tespit etmek için mekanizmalar geliştirmek ortaya çıkarmak ve bitki boyunca ilgili sinyal iletimi, uygun geliştirme ayarlamak zorunda kaldı. İki taşıma sistemleri su, besin ve diğer (sinyal) bileşiklerin dağıtımı için var. İlk ksilem değil, genellikle su taşır ve mineraller bitki boyunca kökleri tarafından alınır hangi. İkinci floem olduğunu. Floem görüşünü RNA için basit asimile taşıma sistemi bir kanal değişti, protein, virüs, lipidler ve diğer küçük moleküller. Bu önemli bir rol oynar asimile ve besin taşıma, biyotik ve abiyotik stres yanıt, hem de bitki büyüme ve gelişme gibi. Şimdi bitki 18 "bilgi otoyolu" olarak adlandırılır.
Floem parankimi, hem de özel arkadaşı CE: floem çeşitli hücre tipleri oluşurlls ve elek elemanları. Elek elemanı uzun mesafe hareketin sitesidir. Engelsiz uzunlamasına akışı için izin vermek için, elek elemanlarının yanı çekirdekleri gibi birçok organeller eksik ve iyi sınırlı bir öteleme makine 21, 33 içeren düşünülmektedir. Bu hücreleridir proteinler ve floem akışında seyahat eden diğer bileşikler, sentez olduğu düşünülmektedir. Bu bileşikler daha sonra plasmodesmata ile elek elemanı içine taşınır ve uzun mesafe sinyalleri 4,16 olarak işlev görebilir.
Bileşiklerin birkaç grup floem sıvılarını bulunabilir:
Bitki floem ile çalışma meydan yaralama üzerine kendisine mühür kapasitesini yatıyor. Orada floem eksuda toplamak için kullanılan dört ana yöntem vardır, ama onlar seçin türlerinde sadece çalışır:
1) cucurbits yılında yaprak sapı kesim ile floem eksüda makul miktarlarda elde etmek mümkündür. Yaralı hücre kontaminasyon başlangıç damla kaldırıldıktan sonra, saf floem sap 1, 15 arasında oldukça büyük bir miktarda elde etmek mümkündür. Ancak, artan toplama zaman, sıvı kromatografi yaklaşımlar (yayınlanmamış) için giderek uygun olmayan bu eksuda kalınlaşır yapma. Son yayınlar türüne göre, bu floem sap eithe türetilmiştir olduğunu, göstermektedirbu elek elemanları (FP) için "mobil" floem sap içeren yapar iken r fasikül (FP) veya extrafascicular floem (AP) ve bu, aynı zamanda ksilem 40 dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, 41 kirlenme eğilimli .
2) İkinci bir yaklaşım kök veya yaprak sapı sığ kesik veya delikler ile floem sap elde etmektir. Bu yöntem, acı bakla 17, 25, 36 kabakgiller ve Brassica napus 12 başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada yaralı hücrelerinden kirlenme az ve çok saf dışkıların. Ancak, bitkiler çok seçici delinme sadece elek elemanları için zor olduğu için sağlıklı ve sulak olması gerekir. Ksilem damarları çentikli ise, tüm eksuda ksilem akışı içine çekilir. Bu çok kırılgan veya yüksek Odunlaşmış sapı veya sapları ile bitkiler için uygun yöntemi yapar.
3) Yaprak biti stylectomy yaprak bitleri elek elemanları içine stile eklemek için izin verirn bir lazer ile yaprak biti kaldırır. Floem sap kalan Stile 2, 9, 10, 35, 38 boyunca yayılır. Teorik olarak, yaprak bitleri tarafından enfekte edilebilir herhangi bir bitki bu yaklaşım için kullanılabilir. Ancak, çoğu sera ya da büyüme odası yöneticileri patojenin kullanımını desteklemez. Buna ek olarak, yaprak bitleri kendi tükürük 19, 33 ile floem içine birkaç proteinlerin tanıtmak. Bu 30 yeniden programlama sınırlı bir transkripsiyonel yol açar ve floem kompozisyon 26 değiştirme potansiyeline sahiptir.
4) Burada anlatılan yöntemi floem sap EDTA-kolaylaştırdı sızma olduğunu. Bu yöntem, floem 20 sızdırmazlık önlemek için EDTA kullanmaktadır. EDTA Ca 2 + aksi floem mühür bu süreçleri katılacak iyonları şelat. EDTA hücre hasarı ile 30 yol açabilir, çeşitli gruplar, hücre ince yapısı veya phloe 20 mM kullanılan bu yöntem, 10 mM EDTA, konsantrasyonlarının olumsuz etkisi gözlemledikm yükleme ve taşıma 5, 24. Herhangi bir zararlı etkisi yanı sıra kromatografisi ve jel elektroforezi ile EDTA girişimi azaltmak için, bitkiler 1 saat sonra suya taşınır ve eksüda sadece sonraki bölümünde 14 kullanılır. Bu nedenle, yerine EDTA içine eksudasyon daha, floem su (EDTA-kolaylaştırdı sızma) içine exudated edilir. Bu floem eksuda toplanması için bir düz ileri, düşük maliyetli ve düşük teknolojili bir yöntemdir. Floem SAP bu şekilde proteinler, küçük moleküller, lipidler ve RNA'lar analiz etmek için kullanılabilecek pek çok bitki elde edilir ve başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Deneyler sınırlı bir miktarda monokotlarda 11 gerçekleştirilirken, bu yöntem dikotlar (Perilla 17, 20, Arabidopsis, 8, 13, 14, Kavak 7) için daha uygun gibi görünmektedir. Eksuda toplanması terleme yoluyla eksuda kaybını önlemek için nemli bir ortam meydana zorundadır. Bitki bağlı olarak, 1-2 saat boyunca, EDTA inkübasyon olduğufloem / elek elemanları sızdırmazlık önlemek için yeterli. Toplama sonra su içine oluşabilir. Bu EDTA hücre yapısı ve istikrar üzerindeki olumsuz etkisi önlenmesi yararı vardır. Ayrıca, HPLC ya da SDS-page gibi yöntemler ile EDTA müdahale ortadan kaldırır. Bu Arabidopsis için geçerli gibi gösterilir. Daha büyük tesisler için, EDTA ve eksüda koleksiyonlarında inkübasyonu ölçeklenmesi sahiptir ve oldukça 1.7 ml'lik tepkime tüpleri daha kap içinde gerçekleştirilir.
Floem eksuda EDTA-kolaylaştırdı toplama, çok basit az ekipman ihtiyacı ve birçok bitki için geçerlidir. Genel olarak, bu yöntem, daha fazla türe floem eksüda analiz yeteneği uzanır. Eksuda seyreltilmiş olmasına rağmen, malzeme büyük miktarda büyütmek için birçok farklı örnekleri toplamak ya da birçok bitkilerden kolaydır. Bu da çok düşük bolca ve aksi takdirde göz ardı edilebilir eden yeni bileşiklerin saptanması için izin verir.
Bu yöntem, birden fazla bitki türleri için kullanılan ve bu yazının listelenen olanlar için tarif olarak çalışıyor olabilir. Yeni tür incelenmiştir ise, değişiklik gerekebilir iki yönü kullanılan yaprak ve eksuda sırasında sayısıdır. Çoğu durumda, bir 5-8 saat eksudasyon uygun olmalıdır. Yeni bitki türleri için bu yöntemin kullanımını doğrulamak için, eksüda protokolü parçası 4 N tarif edildiği gibi toplanır ve sonraki analiz bir veya daha fazla olması gerekireeds yapılacak. Gözlenen sinyal yoğunluğuna bağlı olarak, toplama hacmi büyütülüyor gerekebilir. Eski floem eksuda daha az bol olduğundan Genel olarak, lipid ve protein analizi şeker ve metaboliti analizi daha fazla malzeme gerektirir.
EDTA kolaylaştırılan akıntı tahsilat kesilmiş yüzeyler yanı sıra, EDTA, potansiyel olarak zararlı etkisi içerir için, birkaç nokta dikkat edilmesi gerekir: (1) EDTA ile bir saat inkübe edildikten sonra, yaprak sapı iyice yıkanması gerekir. Bu yaralı hücreleri, hücrelerin zarar verebilir ya da çıkarma engelleyebilir EDTA kendisi, elde edilen herhangi bir bileşik kaldırır. (2) Pozitif ve negatif kontroller elde edilen veriler floem sap elde sağlamak için dahil edilmesi gereken değil, yaralı hücrelerinden (aşağıdaki kritik adımlar bakınız). (3) Floem sap eksuda toplama sırasında aktif olabilir çeşitli enzimler, içermiyor. Bu nedenle, bazı durumlarda, bunun için toplamak için yararlı olabilirZaman r farklı miktarlarda. Yöntem, su içine sızma dahil yana (4), bileşiklerin mutlak değerlendirilmesi mümkün değildir.
Kritik adımda: (. Ref 14) uygun kontrol herhangi bir hücrelerin yanı sıra kullanım zarar vermez için numune taşıma sırasında bu yöntemin başarılı kullanımı için önemli dikkatli kullanılmasıdır. Bir uygun kontrol EDTA ile önceden tedavi olmadan floem dışkılarının topluluğudur. Bu durumda floem kendisi mühür ve hiçbir eksuda toplanabilir. Yaralı hücreleri gelen herhangi bir tehlike bileşikler burada algılanır. İkinci bir kontrol eksüda şekerlerin analizi olacaktır. Arabidopsis, sukroz 1:04 ve 1:08 (ürün 8, 14) arasında bulunan sakaroz oranına sahip fruktoz, floem SAP içinde baskın metaboliti olmalıdır.
RNA ekstraksiyonu için, bir RNaz inhibitörü kullanılması gereklidir. Daha önce describ Buna ek olarak, bir pozitif kontroled floem-lokalize mRNA (UBC9: Ubiquitin bağlayıcı enzim 9, At4g27960, 8, 14) ve örneğin bir negatif kontrol bir kloroplast mRNA (Rubisco LSU) tavsiye edilir.
Eksuda aktif enzimler içerdiğinden, bir süre ders toplama zaman farklılıklar sadece nedeniyle değil floem profilinde emin değişiklik yapmak için tavsiye edilir. Bazı durumlarda, proteinaz inhibitörleri, kullanmak yararlı olabilir. Ancak, araştırmacılar toplanan eksuda konsantre ve eklenen bileşikler büyük ölçüde konsantre olacağını olacağını, akılda tutmak gerekir. Protokol içinde ikinci bir kritik adım EDTA altında yaprak sapı en recutting olduğunu. Bu adım ikili bir amaca hizmet eder: Yeni böylece floem sap serbest akışını sağlayan fişler oluşumunu önlerken İlk olarak, herhangi bir kapalı elek plakaları kaldırır. İkincisi, kesim sırasında oluşan ksilem içinde kavitasyon kabarcık kaldırır ve böylece ksilem taşıma için izin verir. İkinci kesim büyüklüğü bağlıdırkullanılan bitkiler ile ilgili. Büyük sapı ile tesislerde bu Arabidopsis gibi bitkilerde ilk kesim, yukarıda birkaç milimetre (en fazla 1 cm) olmalı, 1-2 mm yeterlidir.
Bu yöntemin kullanımı, gelişim veya biyomedikal etkileri sinyal olabilir floem sızıntıdaki yeni bileşiklerin keşfine yol açabilir. Bu floem erişim eksikliği nedeniyle bitki bilimi içinde az çalışılmış bir alan oldu uzun mesafe lipid sinyal, de derinlemesine bakmak daha yol açtı.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı NSF-IOS hibe # 1144391 için SHB tarafından desteklenmiştir.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |