マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

全ての実験は、住宅、動物の世話は、ガイドラインに付着し、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する2011年NIHガイドラインにプロトコルを用いて行った。 1。 4 – ビニルシクロヘキセンジエポキシドによる治療 VCDの投与プロトコール：化学ドラフト内で、きれいなフラスコに、VCDの0.587ミリリットルを加えごま油で10mlに最終容量をしてから、静かに、カバーを反転させて混合し、パラフィルムで密封する。最大7日間、投与バイアルにソリューションを転送パラフィルムで、それをシールし、4℃で保存する。すべての試薬は、滅菌されていることを確認してください。 VCDは、胡麻油に溶解するように、車両制御などのごま油を使用してください。ストアVCD（MW = 140.2グラム/モル、密度= 1.09グラム/ ml）を-20℃で VCDの注入プロトコル：生後2ヶ月では、重さや部屋の気性の毎日の腹腔内注射を投与し20日間連続して160ミリグラム/ kgの用量でatureのVCD。 2.5ミリリットル/ kgの容量で、ビヒクル溶液、ごま油と同様にして対照マウスに注射する。 注意：噴射期間中は、地元の感染の可能性を減らすために、注射部位を交互にしてみてください。注射のために必要な量を計算するには、次の式を使用します。ソリューションの体重（g）×キロ/千GX 2.5ミリリットル/キログラム=体積（ml）27 Gの針を用いて、約50ミリリットル/注射できるように注入するために。原因針のサイズに局所麻酔薬は必要ありません。 発情周期のモニタリング：噴射期間が完了した後、膣スメアを取得することによって、日々の発情周期を監視する。背首筋法を用いて、マウスを拘束。 0.5cmの深さに、膣口に滅菌生理食塩水0.2ミリリットルをスポイトを挿入します。生理食塩水（3回）、粉砕すると、空白のスライド上に1滴を置く。すぐに顕微鏡で標準光microscを使用してサンプルを評価100Xの大きさで、OPE。 注：膣細胞診はサイクリングの損失を保証するため、卵巣不全を検証と判断された。図2（a）は 、一般的な膣のマウスでの発情周期の異なる段階間で細胞診、すなわち発情前期、発情期、発情後期、17〜19の発情を示している。発情前期の間に、細胞は、有核上皮細胞（ 図2A、矢印は、有核細胞を示す）が挙げられる;発情期の間、細胞は主に扁平上皮細胞角化され;発情は白血球の優位と、細胞型の混合によって特徴付けられる;発情間期は、白血球によって支配されています。焦点面の調整は、サンプル全体の細胞および核を可視化するために必要とされてもよい。 図2Bに示されるように、典型的なマウスの発情周期は4〜5日である。マウスは、持続的な発情間期における15日間連続した後に非環式と見なされます。連続してあたりの試験期間を通じて発情周期を監視するIODは、VCD処理マウスにおける発情周期の欠如を確認した。 2。自主的なケージホイール演習近交系の​​C57BL / 6およびB6C3F1雌マウス、老齢7ヶ月は、自主的なケージホイールランニングにさらされている。 28日間ケージホイールに邪魔されないアクセスをケージ内に個別ハウス動物（47センチメートル×26センチメートル×14.5センチメートル）。 機器のセットアップ：ケージホイール装置は、車輪の回転によって活性化され、デジタル磁気カウンターを搭載した5.0センチメートル広い走行面11.5センチ径ホイールで構成されています。各車輪がテストを実行する前に、メーカーのガイドラインに従ってケージホイールを校正。 、走行輪の内側の直径を測定円周を計算し、ホイールサイズなどのデジタルカウンタにこの値を入力する。 テープを使用して、ホイールスタンドにデジタル磁気カウンタのコンピュータ部分を取り付けます。 コンピューター入力端子を接続しますテープを使用して、ホイールスタンドにデジタル磁気カウンタのイオン。 磁石が再び被害を噛んから磁石を保護するために十分にテーピング、コンピュータにケーブル接続と同じ側の中央のバーにデジタル磁気カウンタの自由なマグネットを取り付けます。ホイールの各回転は車輪の回転を完了するためのいかなる干渉や抵抗なくコンピュータによって記録されるように磁石を配置する必要があります。 注：ダクトテープを走行輪にデジタル磁気カウンタの部品を取り付けるために首尾よく使用されている。テーピングは完全に磁石をカバーし、動物が咀嚼による損傷を防止するのに十分であるべきである。磁石は、その動きを妨げることなく、車輪のできるだけ近くに配置されるべきである。しかし、セットアップはダメージを噛むために毎日監視し、必要に応じて修復する必要があります。 動物用ケージの上部配線を介してホイールスタンドをスライドさせてケージに車輪を取り付けます。トンホイールスタンドを固定しますバインダークリップで、彼はケージの配線。 注意：クリップが離れて動物から、配線の上にある必要があります。ケージの配線を介してコンピュータ部分と余分なケーブルを通します。動物の手の届かないところにコンピュータと余分なケーブルを配置します。これは、中型プラスチックコンピュータと余分なケーブルを保持するためにケージの配線の上に皿を秤量配置することによって達成することができる。 演習：指定されたごみは、ランダムに定住制御や運動療法のいずれかにマウスを割り当てます。すべての動物を水と標準ハード齧歯類固形飼料を自由に与える。 手動磁気カウンタによって与えられた距離のRAN（キロメートル/日）および実行に費やされた合計時間（時間/日）、毎日、値を記録。同じ1時間の時間枠内で記録的距離と時間の値行使期間の28日間の期間を通して、正確で一貫性のある値のための毎日。クリア（ゼロ）正確な読み取りをフォローを確保するために、毎日の記録後の磁気カウンタ日ING。 グループごとに距離と速度の平均値を計算します。各マウスについて、毎日、距離と時間の与えられた値に基づいて速度を計算します。データは、各測定されたパラメータについて毎日または毎週平均値として表示することができる。 組織の収穫：特定の行使期間の終了時に、吸入麻酔下で頸椎脱臼によりケージから取り出し、30分以内に行使し、座りがちな対照動物を安楽死させる。体重を量り取り、迅速に心臓、骨格筋、および卵巣を切除。 組織の収穫時には、マウントしてヘマトキシリンおよびエオシン（H &E; 図2C）で収集された卵巣を染色。拡大して、カウントして、原始の一次、二次、または各VCD処理および対照動物20のための胞状卵胞として分類している。原始卵胞は小さな一次卵母細胞、密接に卵母細胞とは対照的に平坦化されたか、扁平顆粒膜細胞の単層、および基底が含まれていますラミナ。一次卵胞は、卵母細胞を取り囲む単一層に配置された1つ以上の立方顆粒膜細胞の存在によって定義される。二次卵胞は、顆粒膜卵母細胞の周りに複数の層を形成する細胞、および卵胞が含まれています。胞状卵胞は、流体を収容する空洞又は「洞」によって特徴付けられる。 心を切除し、腹側の内側切開すると、振動板を開いた後、心臓を視覚化する。急速に冷リン酸緩衝生理食塩水に十分にウォッシュアウト残留心室血液中のベースと場所で心を切り出す。 、余分な組織の中心部をトリミング心臓全体の重さとスナップ凍結し、液体窒素中。 修飾氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、他のすべての切除された組織を洗浄し、スナップ凍結し、液体窒素で冷却したイソペンタン中。 3。強制トレッドミル運動強制運動パラダイムTを使用する場合O運動能力を測定し、トレッドミルを使用し、次のように設定： トレッドミルランプのベースに電気ショックグリッドを配置します。生成されたこのショックは、運動のための刺激として機能します。電気刺激の強度と頻度は、ユーザーが手動で制御する。グリッドは、有効または各レーンごとに個別に無効にすることができます。すべてのデータ収集は手作業で行われている。 定期的に、メーカーのガイドラインに従って、トレッドミルのキャリブレーションを行います。 トレッドミルコントローラ前面パネルのトグルを「STOP」に設定されていることを確認してください。 所定の位置にしっかり速度トレッドミルベルトレーン1をセンサとは、以下に示すような位置にねじナットで固定します。 トレッドミルコントローラーのフロント·パネル上のダイヤルで、88.7メートル/分に速度を調整後、トレッドミルコントローラフロントパネルに2 Hzに電気刺激周波数を設定します。 キャリブレーション手順を初期化するために「オドメーターリセット」ボタンを押してください。 <stronG>注：定住やnonexercise対照群は、実験計画に含める必要があります。定住グループは、運動群にマッチした時代です。我々は以前の兄弟で収容された定住マウスと比較した場合に行使されたマウスと同じ大きさのケージ内に個別定住マウスが目的のパラメータに影響を与えなかったことハウジングを示している。したがって、座りがちなマウスを行使したマウスと同じ部屋に兄弟と一緒に保管された。 順化：毎日実験前にトレッドミル3-7日にマウス順応。これを行うには、ベルトとトレッドミルでのマウス動かないとショック場所があるが（ノイズ）にベルトモータと、オフグリッド。少なくとも15分間、乱さマウスを残す。 ウォームアップ：このプロトコルで使用されるように、次のようなステップをウォームアップ。 トレッドミル上で各マウスを置きます。ショックグリッドを無効にし、15分間4メートル/分にベルト速度を上げる。 ショックグリッドを有効にして、ベルト速度を維持さらに10分間4m /分のベルト速度。 運動トレーニングレジメンウォームアップに続いて、グリッドのショックを維持し、15分間、5m /分にベルト速度を増加させる。 さらに15分間15メートル/分にベルト速度を上げます。 訓練の後、戻ってケージにマウスを転送します。 注：本研究では、運動トレーニングを1週間毎日行った。 急性運動療法：急性運動療法は、極度の運動負荷の短期的および長期的な影響を判断するために設計されています。 ウォームアップに続いて、10、15、20、25に5m /分のベルト速度を増加させ、30m /分、10分間隔で。 注：マウスが動作して続行するか、消耗や苦痛の徴候を示すことができない場合の練習を終了します。我々の研究では、ほとんどの動物は、25m /分で停止し、動物がまだ30m /分の段階を通過しなかった。 各テストの間に2〜3日できるように、各マウスを3回テストします。すべてEXER全体の平均値を計算する各マウスのCISEセッション。 持久力のための運動療法：持久運動プロトコルはトレッドミル運動刺激に長時間露光のためにマウスを訓練するために設計されています。このタイプのプロトコルは、適度な運動ストレスの長期的影響に耐える能力を試験する。 ウォームアップ期間中に概略をベルト速度で始まり、4メートル/分。 徐々に20μmの最終速度まで1m/minによりベルト速度を増加/分に達した。典型的な試験プロトコールの合計時間は50分である。 運動療法の後、戻ってケージにマウスを転送します。 注：枯渇への実行マウスが回避される。実験中の任意の時点でマウスが枯渇の兆候を示した場合は、ショックグリッドを非アクティブにし、マウスは休息と回復することができます。 4。データと統計解析として今回の結果は、平均±SEMと2方向ANOVA（治療群とEXEを使用主な要因としてrciseは）学生 – ニューマンクールズ事後検定または平均値の差を比較するためにスチューデントのt検定を行った。 定住グループの平均心臓質量に各行使動物の質量を比較することで、運動と心臓の質量の変化率（％）を決定します。心臓質量の差は、それぞれの動物について座りがちな動物からのパーセント変化として表される。 <0.05のp値は統計的に有意であると考えられる。