JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Engineering

כיוון עדין גודל ומזעור הרעש של מצב המוצק Nanopores

Published: October 31, 2013
doi:
10.3791/51081
, , ,
1Department of Physics,University of Ottawa, 2Ottawa-Carleton Institute of Biomedical Engineering,University of Ottawa

Summary

מתודולוגיה להכנת nanopores מצב מוצק בפתרון לניסויי טרנסלוקציה biomolecular מוצגת. על ידי יישום פולסים קצרים של שדות חשמליים גבוהים, בקוטר nanopore ניתן להגדיל מבוקר בדייקנות subnanometer ומאפייני הרעש החשמלי שלה השתפרו באופן משמעותי. הליך זה מבוצע באתרם באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי בתנאי ניסוי.

Abstract

nanopores מצב מוצק צמחו ככלי תכליתי לאפיון של ביומולקולות בודדת כגון חומצות וחלבונים 1 גרעין. עם זאת, היצירה של nanopore בקרום בידוד דק נותרת מאתגרת. שיטות ייצור הכוללות מערכות אלומת אלקטרונים ממוקדים מיוחדות יכולות לייצר nanopores מוגדר היטב, אבל התשואה של nanopores אמין ורעש נמוך בקרומים זמינים מסחרי נותרת נמוכה 2,3 ובקרת גודל היא לא טריוויאלי 4,5. הנה, את היישום של שדות חשמליים גבוהים כדי לכוונן את הגודל של nanopore תוך הבטחת ביצועי רעש נמוך אופטימליים מודגם. פולסים קצרים אלה של שדה חשמלי גבוה משמשים לייצור אותות חשמליים טהורים ולאפשר להגדלת של nanopores עם דיוק subnanometer בחשיפה ממושכת. שיטה זו מבוצעת באתר בסביבה מימית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי, שיפור התשואה והשחזור של יםייצור nanopore-Olid מדינה.

Introduction

nanopores-מצב המוצק ביולוגי ולספק אמצעי חישת analytes biomolecular ברמת המולקולה בודדת 1. nanopores הבודד משובץ בדרך כלל בקרום דק מבודד, המספק את הצינור רק לזרם היוני לעבור בין שני מאגרי מים נוזליים. ניצול העקרונות של מוני קולטר בקנה מידה גדולה, ניסויי nanopore מתייחסים לשינויים בזרם היוני כדי לקבוע את האורך, גודל, תשלום וקונפורמציה של ביומולקולות הטעונה כפי שהם מונעים electrophoretically דרך nanopore בנוכחות שדה חשמלי חיצוני.

בעוד nanopores הביולוגי כגון α-hemolysin בדרך כלל מציע את רגישות ואת מאפייני רעש נמוך 3 גדולות יותר, bilayer השומנים התמיכה הוא שברירית ושל גודל קבוע, הגבלת התחולה שלהם. nanopores מצב מוצק, לעומת זאת, מיוצרים בניטריד הדק (10-50 ננומטר) סיליקון או קרומי תחמוצת סיליקון ויכול להיות עשוי מsiz שונהes, להיות משולב בקלות עם טכנולוגיות רקיק בקנה מידת 6,7, והם חזקים יותר, ומאפשרים למגוון רחב יותר של תנאי ניסוי. למרות יתרונות אלה, טכנולוגיות nanopore מצב מוצק סובלות מכמה חסרונות מעשיים המגבילים את התועלת שלהם ללימודי biomolecular. בעוד שליטה על גודל nanopore אפשרית, זה הוא בדרך כלל יקר ומייגע כדי להשיג, הדורש ציוד מיוחד וכוח אדם מיומן. לדוגמא, nanopores נקדח על ידי אלומה ממוקדת יון הוכח לאחרונה להתכווץ בתנאי ניסוי ספציפיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) 5. בגישות אחרות, nanopores נקדח על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) יכול להרחיב או לכווץ בהתאם לתנאי הקרן והחשיפה לאחר ממסים מימיים 8. במקרים אלה, בטווח השגה בגדלים nanopore מוגבל, קשה לשליטה, ואף בלתי אמין כמו הגודל של nanopore יכול להשתנות בעקבות טיפול כימי אוכאשר שקוע בסביבה נוזלית מסוימת 9.

הנוכחי היוני דרך nanopores מצב מוצק יכול לסבול גם מרעש גבוה, המקורות מהם הם נושא שנחקר באינטנסיביות בספרות nanopore 2,3,10,11. בעוד שיטות שונות הוצעו כדי להפחית את הרעש חשמלי, התשואה של nanopores אמין, יציב רעש הנמוך היא בדרך כלל נמוכה. בתצהיר של שאריות הפחמני במהלך קידוח והדמיה יכול להיות השפעה מזיקה על איכות האות החשמלית, שהופך לעתים קרובות הרטבה מלאה אתגר וגורם להיווצרות nanobubbles שיכול להיות קשה להסיר 12. יתר על כן, סתימה של nanopore על ידי מולקולות אנליטי מדרדרת את איכות אות טיוח נקבוביות בלתי שמיש עבור ניסוי נוסף 13,14. בסך הכל, תופעות אלה לצמצם במידה ניכרת תשואה של מכשירי nanopore פונקציונליים ולהגדיל את העלות כרוכה במחקר nanopore של מצב מוצק.

Application של מתח עם אלקטרודות Ag / AgCl לייצר שדות חשמליים גבוהים בטווח של 0.15-.3 V / ננומטר מציג פתרון פשוט באופן מפתיע לאתגרים אלה. באמצעות היישום המחזורי של פולסים קצר במתח,, רעש נמוך משטח nanopore אידיאלי נקייה ללימודי מולקולה בודדת הוא מיוצר. חשיפה ממושכת לשדות חשמליים גבוהים יוזמת את הסרת חומר הקרום מהווה את הקיר הנקבובית, וכתוצאה מכך גידול בקוטר nanopore. גידול זה ניתן לשלוט באופן מדויק על ידי כוונון עוצמת הדופק ומשך הזמן. כעקבות הנוכחיות בזות במהלך ניסוי בשל סתימה של nanopore כמולקולות לספוג אל פני השטח nanopore, ניתן לחזור על תהליך זה כדי לשחזר מכשירים סתומים שמקרה אחר היה מושלך. ככזה, התשואה של nanopores הפונקציונלי הוא גדל עוד יותר על ידי היכולת להשתמש באותו המכשיר מספר פעמים. שיטה זו מספקת מספר יתרונות כפי שהוא מתבצע במהירות בנוזל בניסויתנאים, דורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי, יכולים להיות אוטומטיים עם תוכנה, ומייצר nanopores באיכות גבוהה הפונקציונלי עם תשואה של מעל 95%.

Protocol

1. ייצור nanopore וניקוי הערה: לאחר nanopore קיים בקרום בידוד, זה יכול להיות מותקן ישירות בנוזל התא ללא עיבוד או ניקיון נוסף, כפי שמתואר בשלב 2. עם זאת, אם יש צורך להסיר עקבות של חומרים מזהמים בין ניסויים, ניתן לנקות שבבי nanopore או באמצעות פתרון Piranha 3,15,16 (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) או על ידי חשיפה לחמצן פלזמה 2. ככזה, על שלבים 1.2-1.9 בפרוטוקול הבא הם אופציונליים אם precleaning על ידי חשיפה לפתרון Piranha אינו הכרחי. דגה מסוננת deionized מים (DI) על ידי הצבת תחת הוואקום בsonicator ל30 דקות ב40 ° C. הכן את פתרון Piranha בכוס 10 מיליליטר על ידי הוספה בזהירות 3 מיליליטר חומצה גופרתית ואחריו מי חמצן 1 מיליליטר. מערבבים היטב על ידי refluxing בפיפטה. זהירות: פתרון Piranha הוא מסוכן ביותר. אנא ta Ke בכל אמצעי הזהירות. באמצעות פינצטה עמידה חומצה, הכנס בזהירות את שבב הקרום המכיל nanopore הקצה ראשון לפתרון Piranha לצלול לחלוטין את השבב ולהימנע מכך צף על פני השטח. יש לשטוף ביסודיות בפינצטה מים מסוננים. מניחים את הכוס על הגדרה קבועה מראש פלטה חמה ל90 ° C ולאפשר לו לנקות לפחות 30 דקות. מוציא בזהירות את פתרון Piranha מהכוס באמצעות פיפטה זכוכית נקייה וזורקים בכמויות עצומות של מים. בעזרת פיפטה זכוכית נקייה להוסיף 5 מיליליטר של המים deionized degassed משלב 1.1 לתוך הכוס כדי לשטוף. הסר את המים ולחזור לפחות 5x. מוציא בזהירות את שבב nanopore מהכוס באמצעות פינצטה חדה קצה נקי. טפל בזהירות רבה כקרום nanopore הוא מאוד שביר. ייבש את השבב בעדינות על ידי החלת יניקה לקצה שלה באמצעות aspirator. אחסן את השבב בצלחת פטרי נקייה עד מוכן לשימוש. ve_title "> 2. ההרכבה Nanopore נקה את תא nanopore הטפלון (איור 1) על ידי הצבת ב20% תמיסת חומצה חנקתית ורותח במשך 10 דקות. זהירות: השתמש בכל ציוד מגן האישי הנחוץ ולטפל חומצות בזהירות. מוציא בזהירות את התא מחומצה חנקתית ומקום במים די רותחים למשך 10 דקות. מרתיחים את התא במים די לנוספים 10 דקות כדי להבטיח הסרה מלאה של חומצה חנקתית מלאה. הסר את הכוס מהצלחת החמה ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת חדר. הסר את התא מהכוס ומכה יבש עם אוויר או N 2 מסוננים. אחסן את התאים בצלחת פטרי נקייה. דגה מסוננת פתרון KCl (שנאגרו עם HEPES ב-pH 8) על ידי הצבת תחת הוואקום בsonicator ל30 דקות ב40 ° C. אטמים נקיים שני אלסטומר סיליקון עבור כל שבב nanopore ידי sonicating באתנול במשך דקות לפחות 10. הנח את שבב nanopore על carefu הוויה אטם אלסטומר נקיl כדי ליישר את חלון הקרום עם פתיחת האטם. מקום וליישר אטם שני על גבי השבב. הנח את השבב ואטמים בכניסת המאגר של חצי אחד של תא nanopore ניקה. להרכיב את התא על ידי הברגה את החצי השני במקום. תצוגה התפוצצה ממרכיבי תא nanopore מוצגת באיור 1. להרטיב את שבב nanopore ידי pipetting אתנול לתוך מאגרי התא והצבה בתא ואקום עד כמה בועות נראות כדי לצאת מפתחי הכניסה. הסר אתנול על ידי שטיפת המאגרים עם לפחות 3 מיליליטר degassed פתרון KCl מסונן. תשמור על עצמך כדי להסיר עודפים באמצעות aspirator. 3. Nanopore אפיון הנח את תא nanopore בהתקנה הניסיונית מוגנת חשמלי ומניח אלקטרודות Ag / AgCl בכל מאגר. התקנה זו היא דומה לזה שמוצג באיור 2 למעט האספקה ​​החיצונית הכוח והמגבר הנוכחי שהןהוחלף במגבר משוב התנגדות רעש נמוך. שימוש במגבר בעל רעש הנמוך במצב המתח-clamp, להחיל פוטנציאלים גורפים מ-200 mV ל+200 mV ולהקליט את המאפיינים הרביעי. להתאים את עקומת IV להשיג מוליכות nanopore, אשר יכול לשמש כדי לחשב את קוטרו בפתרון 17. אם הקוטר המחושב הוא הרבה יותר קטן מצפוי מהדמית TEM, הנקבוביות עשוי לא רטוב לחלוטין ו / או מכיל פסולת או זיהום. החלת פוטנציאל mV 200 פני nanopore ולהקליט הנוכחי היוניים ל30 שניות. לבצע צפיפות ספקטרלית כוח ניתוח (PSD) של הזרם היוני ולשלב לכמת את מאפייני רעש החשמלי של nanopore. אם הרעש הוא מעל 15 הרשות הפלסטינית RMS ב5 רוחב פס kHz, אז נקבוביות עשוי לא רטוב לחלוטין ו / או מכיל זיהום, ולא ניתן להשתמש בו באופן מהימן בניסוי. 4. אוויר Nanopores שימוש גבוה Fie חשמליLDS הערה: אם עקומת IV נוצרה אסימטריה הציגה או פחות מהצפוי מוליכות, או העקבות הנוכחיות הראו רמות יציבות ורעש גבוה בתדרים נמוכים, יש צורך להתנות את nanopore עם שדות חשמליים גבוהים כדי להסיר כל זיהום בנקבובי שטח ו / או להרטיב את הנקבוביות. בעוד ששיטה זו אינה משפיעה על הרעש בתדר גבוה הנגרם על ידי קיבול הקרום או כל קיבול טפיל מצמידים את הכניסה של המגבר הנוכחי נעשה שימוש במדידות, רעש בתדר נמוך (המכונה גם רעש 1 / f) 18 יכול להיות מופחת באופן משמעותי. סכמטי של ההתקנה המשמשת לביצוע מיזוג זה מוצג באיור 2. נתק את האלקטרודות ממגבר תיקון מהדק. חבר אחד של אלקטרודות לאספקת חשמל מבוקר מחשב מסוגלת לייצר> 6 V (> 0.2 כוח V / ננומטר שדה חשמלי לקרומים העבים 30 ננומטר משמשים כאן) והשני לדוארxternal מגבר הנוכחי שיכול להיות במעקב בזמן אמת. הערה: היישום של שדות חשמליים גבוהים יכול לשמש להתנות nanopores בחומרי קרום שונים ועוביים. בעוד שני קרומי 30 ננומטר ו10 ננומטר נדונים כאן, המתחים תיארו מתייחס לאלה המשמשים לקרומים עבים 30 ננומטר, אלא אם כן צוין אחרת. החל הפרש פוטנציאל של 400 mV (מתח מדידה) על פני nanopore במשך לפחות 5 שניות. לחשב את הערך הנוכחי הממוצע מהשניות 1 הסופיות של הנתונים כדי לקבוע את המוליכות של nanopore. לחשב את הקוטר של nanopore מבוסס על מוליכות חשמלית של זה, אשר צריך להיעשות באופן אוטומטי באמצעות התוכנה ומודל מוליכות nanopore של בחירה על בסיס הסביר להניח הגיאומטריה. זה צריך להתאים לקוטר נמדד מעקומת IV. החל דופק msec 200 של 6 V (מתח הרטבה) על פני nanopore לייצר שדה חשמלי של 0.2 V / ננומטר ואחרי תקופת מדידה 5 שניותב400 mV. שוב, לחשב קוטר של nanopore באמצעות 1 שניות הסופיות של הנתונים ולהשוות עם הערך הצפוי ממדידות TEM כדי להבטיח שnanopore הוא רטוב באופן מלא. אם יש צורך, חזרו מספר פעמים. אם יש צורך, חזרו על היישום של פולסים של שדה חשמליים גבוהים עם מתח גובר, עד שהאות הנוכחית במהלך תקופת המדידה הוא יציב ומראה את המוליכות הצפויות. לא מומלץ לעלות על 10V ל( כלומר> 0.3 V / ננומטר), כמו זה יכול להגדיל או לגרום נזק לnanopore במהירות באופן משמעותי. 5. הגדלת Nanopores שימוש בשדות חשמליים גבוהים הערה: בקוטר של nanopore הוא מכריע בקביעת הפונקציונליות שלו ליישום חישת biomolecular מסוים. לשם כך, nanopore נוצר באמצעות TEM ניתן להגדיל לגודל רצוי על ידי הפעלת שדות חשמליים גבוהים עד הקוטר המתאים מושגת עם ההתקנה זהה המשמשת לניקוי ולהרטיב אתnanopore (איור 2). שימוש באותה התצורה אלקטרונית כמו בחלק 4, להחיל הטיה mV 200-500 פני הנקבובית כדי להשיג מדידת קוטר. בעוד פחות מדויק מהולם עקומת IV, מדידת נקודה אחת יכולה לשמש לבערך להעריך את גודל nanopore במהירות. החל דופק 2 שניות של 8 V פני nanopore אחרי תקופת מדידה של לפחות 5 שניות ב400 mV. חישוב הקוטר החדש יהיה בדרך כלל להראות עלייה קטנה מאוד בגודל nanopore (<0.1 ננומטר). חזור על תהליך זה באופן מחזורי, לסירוגין בין מתחי הגדלה ומדידה כדי להשיג באתר ומדידות של הגדלת קוטר nanopore בזמן אמת. אם שיעור צמיחה מהיר יותר הוא רצוי, להגדיל את עוצמת המתח להחיל באופן הדרגתי עד 10 V. צמיחה יהיה בדרך כלל להאיץ כמו הנקבובית מגדילה בשיעור העלייה במוליכות החל 0.03 nS / s # EC &160; ל10 nS / שניות, תלוי בגודל של nanopore, עוצמת השדה החשמלי ומאפייני תמיסת אלקטרוליט. כאשר מגיע לקוטר הרצוי, לעצור את היישום של שדות חשמליים גבוהים. ניתן לעשות זאת באופן אוטומטי באמצעות תוכנת המחשב. חבר מחדש את מגבר תיקון מהדק לאלקטרודות. לרכוש IV החדש ונתונים עקבות הנוכחיים ב200 mV כדי לאשר את הקוטר של nanopore ולאמת אותות הנוכחיים רעש נמוך כמו בשלבים 3.2-3.5 לעיל. אם יש צורך, חזור על אוויר ופרוטוקול הרחבת (שלבים 4.1-5.5). 6. ה-DNA טרנסלוקציה לפני הוספת מדגם biomolecular, לבצע ניסוי שליטה על מנת להבטיח שאין זיהום במאגר. לרכוש עקבות הנוכחיות תחת פוטנציאל היישומי של 150-300 mV בהעדר כל דגימה כדי לוודא שאין חסימות הנוכחיות זוהו לאחר 2 דקות. הוספת דנ"א λ (48.5 kbp גדילים כפולים-) ל<em> מאגר cis לריכוז סופי של 0.5-2 ng / μl. ריפלוקס בעדינות על ידי פיפטה לפחות 10 שניות כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של המדגם בכל המאגר. לnanopore העבה 30 ננומטר, להחיל הטיה פוטנציאלית של 150-300 mV למאגר טרנס ולמדוד את הזרם העובר דרך היוני nanopore. לאירועי טרנסלוקציה קצרים מאוד, רצוי לדגום בתדר גבוה (250 קילוהרץ או יותר) בתדירות גבוהה יחסית נמוך לעבור סינון (100 קילוהרץ). לפקח הנוכחי היוני באמצעות תוכנה לאיתור חסימות הנוכחיות חולפות כמולקולות translocate דרך nanopore. העקבות הנוכחיות יוניות של טרנסלוקציה המולקולרית ניתן לנתח כדי לקבוע עומק חסימה, משך ותדירות להסיק מידע על המדגם של עניין. לעומת זאת, אם מידע על מולקולות translocating ידוע, מידע זה יכול לשמש כדי לחקור מאפיינים של nanopore עצמו.

Representative Results

Nanopores שימש במחקר זה שנקדחו ב30 ננומטר או חלונות קרום סיליקון ניטריד העבה 10 ננומטר. בעוד הפרוטוקול המתואר יכול להיות מיושם על nanopores מצב המוצק של חומר שונים מפוברק באמצעות כל שיטה, הם קדחו בדרך כלל על ידי TEM באמצעות פרוטוקולים הוקמו בעבר 11,14. Nanopores נקדח על ידי TEM הוא בדרך כלל בין 4-8 ננומטר בקוטר (איור 2). אמנם יכולים להיות מותקנים שני קרומים העבים 30 ננומטר ו10 ננומטר והתנו באמצעות הפרוטוקול לעיל, הטיות מתח תיארו מתייחסות אלה הנדרשים עבור ממברנות עבות 30 ננומטר, אלא אם כן צוין אחרת. לממברנות של גודל שונה, המתח להחיל צריכה להיות מותאם כדי ליצור שדה חשמלי בטווח של .15-.3 V / ננומטר בתוך nanopore. איור 3 א מציג שתי עקבות מוליכות טיפוסיות של nanopore 10 ננומטר בקרום עבה 30 ננומטר לפני ואחרי טיפול בשדות חשמליים גבוהים. עם ההרכבה חדשה דמלא את nanopore, את הסבירות של קבלת אות הנוכחי יוניים יציב ורועש, מפגין רמה גבוהה של תנודות בתדירות נמוכה, היא גבוהה בדרך כלל. Nanopore שמוצג באיור 3 א מדגיש את ההתנהגות הזאת. המוליכות שלו היא הרבה פחות מהצפוי לnanopore הגודל שלה, ככל הנראה בשל הרטבה לא שלמה. על פי הבקשה של שדות חשמליים גבוהים של 0.27 V / ננומטר בגודל המיוצר על ידי 8 V קטניות (90 פולסים של 2 משך שניות), nanopore הופך רטוב באופן מלא והוא הורחב לאחר מכן ל21 ננומטר בקוטר. בשלב זה, הנקבובית מציג מוליכות יציבה עם מאפייני רעש נמוך. ניתוח כמותי של רעש בnanopores הדומה מוצג כחלקות צפיפות ספקטרלית כוח ב3 ב איור. משרעת הרעש בתדר הנמוך של הנקבוביות unwet ו / או סתומים הוא גבוה מאוד (> 20 הרשות הפלסטינית RMS), הופך אותם לבלתי שמיש בניסוי. לאחר מיזוג עם שדות גבוהים חשמליים, עוצמת רעש בתדרים נמוכים (<10 קילוהרץ) הוא diminisהד בשיעור של עד 3 סדרי גודל ומוכנים לניסויי רעש נמוך. תרשים 4 א מציג מדידה נוכחית טיפוסית כפוטנציאל מיושם הוא פעמו בין שדות חשמליים גבוהים להגדלת ולתקופות מדידת שדה החשמלי נמוכות. אחרי דופק בכל שלאחר מכן, הזרם היוני שנוצר דרך nanopore במתח המדידה (כלומר מוליכות nanopore) מגדיל בסכום סופי. זה מוכיח כי nanopore הוא גדל בגודל, כד הקוטר ניתן להסיק מהמוליכות שלה G בתמיסה של σ מוליכות, המתקרב nanopore כבעל גיאומטריה גלילית של eff L אורך אפקטיבי. בעוד מודלים שונים קיימים לנוגעים מוליכות nanopore לגיאומטריה שלו 17,19-21, ביחס הבא, אשר משלב טווח גיאומטרי והתנגדות קצרה טווח קיימת גישה, הוכח בתוקף לnanopores נקדח-TEM במלח גבוהריכוזים, על פני טווח רחב של קטרים ​​של עניין לטרנסלוקציה dsDNA 17,22. ברגע שהוא הגיע לקוטר הרצוי, התהליך נעצר באופן אוטומטי על ידי התוכנה. קוטר nanopore וכתוצאה מכך לאחר מכן ניתן לאשר באמצעות מדידות IV מדויקות, כפי שמוצג באיור 4. חשוב לציין כי nanopores טופל באמצעות שדות חשמליים גבוהים הם מתפקד במלואה. זה אומת על ידי זיהוי של טרנסלוקציה DNA λ, כפי שמוצגים בעקבות המוליכות מוצגות באיור 5 א. בנתון זה, dsDNA הוא מונע באמצעות שני nanopores שהורחבו ל11 ננומטר ו32 ננומטר באמצעות השיטה המתוארת. בכל מקרה, המוליכות הבסיסיות היא יציבה מאוד וחסימות ברורות הם נצפו כמולקולות dsDNA translocate דרך nanopore, בו מוצגות גבוהה אות לאירועי רעש מולקולה בודדת טרנסלוקציה לעומת נקבוביות שלא טופל כי תערוכת רעש גבוה. כפי שניתן לראות בריבועים של הציור 5a, רמות חסימה בדידות מרובות הם נצפו כמולקולות בודדות מקופלות translocate, כצפוי לnanopores בגדלים אלה. היסטוגרמות של מוליכות nanopore במהלך אירועי טרנסלוקציה דרך כל נקבובית מוצגות באיור 5. מאפייני הרעש הנמוך של nanopores לחשוף שיאים ברורים, קלות לפתרון מתאים לנקודת ההתחלה (לא ה-DNA), (גדיל DNA אחד – פרש) יחיד ומדינות כפולות חסימה (שני גדילים ה-DNA – מקופלת). ראוי לציין היא העובדה שהשינוי במוליכות המתאימה למולקולה בודדת dsDNA הכובש הנקבובית הוא שונה עבור nanopores הקטן והגדולים. זה מספק ראיות עקיפות כי היישום של שדות חשמליים גבוהים הוא למעשה הגדלת nanopores הקיים, כפי שאותה משרעת החסימה תהיה ציינה אם נקבוביות או סדקים אחרים נוצרים בtהוא הקרום במהלך התהליך 17. באופן דומה, איור 6 מדגים את האפקטיביות של שדות חשמליים גבוהים להגדלת nanopores המפוברק בממברנות בעובי שונה. הנה, nanopore שנוצר בקרום SiNx 10 ננומטר הוא תחילה unwet באופן חלקי, בו מוצגות מוליכות לא יציבים וקטנות יחסית. על פי הבקשה של חילופין ± 3 V (± 0.3 V / ננומטר) פולסים של משך 4 שניות (30 סך הכל), nanopore הופך רטוב ומציג מאפיינים רביעי אידיאליים עבור נקבובית 3 ננומטר. המתודולוגיה הייתה אז חזר ל400 פולסים שלאחר מכן וnanopore הורחב עד 8 ננומטר. הגדלה זו, שבוצעה בשדות חשמליים דומים אבל הטיה מתח מיושמת נמוך יותר מאשר לnanopores המפוברק בקרומי 30 ננומטר, מראה כי התהליך הוא שדה בעיקר חשמלי מונע. כמצור הנוכחי מיוצר על ידי טרנסלוקציה דרך קרום דק יותר הוא גדול יותר מזה המיוצר בעבה נקבוביות, nanopores בקרומים דקיםטופל באופן זה יכול לשמש כדי לחקור מולקולות קצרות יותר כגון חלבונים עם רגישות מוגברת. איור 1. ההרכבה תא nanopore. קרום המכיל סיליקון ניטריד nanopore ממוקם בין אטמי סיליקון אלסטומר, אשר בתורו הדחוס על ידי שני טפלון חצי תאים המכילים מאגרי אלקטרוליט. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 2. אוויר nanopore והרחבת הגדרה. nanopore נקדח בקרום 30 ננומטר סיליקון העבה ניטריד (משמאל) מחבר בין שני מאגרי אלקטרוליט.מחשב משמש לשליטה או מגבר התיקון-clamp או אספקה ​​חיצונית כוח (כרטיס DAQ) אשר חלה הטיה פוטנציאלית ברחבי nanopore באמצעות אלקטרודות Ag / AgCl השקוע במאגרי אלקטרוליט. המגבר הנוכחי מעביר את הזרם היוני שנמדד כדי להיות במעקב בזמן אמת באמצעות תוכנת מחשב. נתון זה שונה מ[ 11]. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 3. עקבות הנוכחיות לפני ואחרי היישום של שדות חשמליים גבוהים. (א) בעת ההרכבה, וגם לאחר ניקוי עם פתרון Piranha, המוליכות של nanopore אינן יציבות ופחות מהצפוי לנקבובי גלילי 10 ננומטר (כחול). לאחר היישום של 2 פעימות לשנייה של 8 V,nanopore הוא רטוב באופן מלא ומורחב, המציג מוליכות יציבה ויכול לשמש לניסויי biomolecular חישה (ירוק). (ב) חלקות צפיפות ספקטרלית כוחה של nanopore חלקי רטוב והסמיך (כחולה וכתום, בהתאמה). על פי בקשה של 200 פולסים אלפיות של 8 V, nanopores הורטב ופסולת הוסרה (ירוק ואדום, בהתאמה). נתון זה שונה מ[ 11]. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 4. Nanopore הרחבת באמצעות שדות חשמליים גבוהים. (א) לסירוגין בין ההרחבה ומדידת הטיות אפשריות (אדום) מגלה שהזרם היוני דרך nanopore (הכחול) מגביר בשלבים סופיים. התנהלות וכתוצאה מכךמדידה אהה ניתן להשתמש כדי להסיק קוטר nanopore. ברגע שהקוטר הרצוי הושג, התהליך נעצר. (ב) מדידות IV מדויקות של מוליכות לאשר כי גדלי nanopore גדלו. מגרשים כאלה לספק הערכה טובה יותר של הגודל הנקבובית יותר מערכים הנוכחיים נקודה אחת כפי שהם יכולים להיות בכושר וההתנהגות הסימטרי וOhmic ניתן לאשר. נתון זה שונה מ[ 11]. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 5. טרנסלוקציה DNA דרך nanopores המותנה. (א) התוספת של dsDNA (48.5 kbp) לצד אחד של nanopore בהטיה של 150 mV מייצרת חסימות זמניות בעקבות המוליכות של 11 ננומטר (כחול) וpor 32 ננומטרes (אדום). (ב) היסטוגרמות של המוליכות של כל אחד מnanopores להראות פסגות דיסקרטיות המתאימות לתחילת המחקר, יחידה ואירועים כפולים טרנסלוקציה. נתון זה שונה מ[ 11]. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. איור 6. הגדלה של nanopores ב10 קרומי ננומטר. Nanopore בקרום 10 ננומטר במקור מוליכות מעט מאוד תערוכות ומאפיינים רביעי סימטריים (כתום). על פי הבקשה של 30 פולסים של לסירוגין בין ± 3 V (משך שניות 4), מרטיב nanopore ומציג מאפייני IV אידיאליים עם מוליכות עולות בקנה אחד עם זה צפוי לנקבובי 3 ננומטר (כחול). נוספים 400 פולסים של ± 3 V מגדילים nanopore לקוטר של 8 ננומטר(ירוק). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

שליטה על גודל nanopore היא בעל חשיבות עליונה ביישומי חישת biomolecular. קטרי nanopore חייבים להיות על סדר הגודל של המולקולות שנחקרו, הם חייבים להיות גדולים מספיק כדי להכיל את המדגם אך קטנים מספיק כדי להשיג רעש אות לאופטימלי. בעוד השליטה על הגודל באמצעות השיטה המוצגת של החלת שדות חשמליים גבוהים הוא חד כיווני שבקטרי nanopore הם רק גדלו לאורך כל התהליך, nanopores בקטרים ​​שבין 3-100 ננומטר יכול להיות מיושן, עם דיוק subnanometer. כ3-4 ננומטר נקבוביות יכול להיות מפוברק בקלות באמצעות TEM 23, זה מאפשר לייצור אמין של nanopores מצב מוצק למגוון רחב של יישומים מחיטוט מבנה ssDNA לאינטראקציה של קומפלקסי חלבונים ליגנד מגושמים. בעוד צמיחת nanopore מעל 100 ננומטר יכולה להיות מאוד מהירה ופחות מדויקת, יכולים להיות מועסקים בתנאי הרחבת מתונים יותר כדי להשיג שליטה טובה יותר על התהליך. כמו יםuch, הצעד החשוב ביותר להשגת שליטה אפקטיבית גודל הוא הבחירה של חוזק ומשך דופק על מנת לאזן יעילות גדלה ורמת הדיוק הנדרש בהשגת קוטר נקבובית רצוי. זה מודגש עוד יותר על ידי הגדלה של nanopores דק יותר (עובי 10 ננומטר), שבו הגדלה הוא ציין נטייה נמוכה יותר, אך עוצמת שדה חשמלי דומה. בהתאם לגודל הסופי, זה בדרך כלל אפשרי להגדלת nanopore לקטרים ​​תת -100 ננומטר בכמה דקות.

בדומה לכך, תנודות הנוכחיות בתדירות נמוכה גדולות מונעות מחקרי מולקולה בודדת כפי שהיא כמעט בלתי אפשרי להבדיל אותות טרנסלוקציה מרעשי רקע. שלם הרטבת 24, הנוכחות של שאריות הפחמני שנותרו לאחר ייצור ראשוני 25 וספיחה של פסולת על קיר nanopore 13 יכולה להשפיל את איכות אות, הדורשת ניקוי נוסף עם טיפולים כימיים קשים שלעתים קרובות אניnefficacious. מעניין, זה נפוץ פרוטוקולי nanopore מצב מוצק כדי להדגיש את החשיבות של ניקוי nanopore בפתרון Piranha או עם פלזמה חמצן לפני ההרכבה כדי לסייע הרטבה או להסיר כל זיהום שנותר מתהליכי הקידוח, הדמיה וטיפול. אפילו עם טיפול זה, עם זאת, nanopores לעשות לעתים קרובות לא רטוב או ממשיך להפגין רעש גבוה, והפתרון שהוצע לניסיונות כושלים הוא לבצע ניקוי נוסף אשר יכול להיות מאוד זמן רב 14. עם היישום של שדות חשמליים גבוהים, הפרוטוקולים ארוכים הללו לא עשויים להיות נחוצים, בהתאם ליישום. נמצא כי רוב המכשירים יכולים להיות משופצים באתרם באמצעות השיטה המתוארת במסמך זה, צמצום זמן הכנה ואת הצורך להתמודד עם כימיקלים קשים כתוצאה מכך. הצעדים החשובים ביותר במקלי רעש חשמלי הוא עלייה פשוטה במתח ו / או משך דופק להרטיב לחלוטין הנקבובית ולהסיר פסולת באופן רופף בכריכה.Nanopores טופל באופן זה יכול אמין לשמש בניסויי טרנסלוקציה biomolecule, כגון המעבר של דנ"א וחלבונים. אם מולקולות אלה לדבוק בקיר הנקבובית המוביל לאות חשמלי סתום ורועש, ניתן להחילה מחדש פולסים של שדה חשמלי גבוהים כדי להסיר את החסימה ולהחזיר את מאפייני רעש נמוך לניסויים נוספים, ללא unmounting של שבב nanopore מתא fluidic.

היישום של שדות חשמליים גבוהים באמצעות ההתקנה המתוארת הוא מוגבל על ידי הדרישה של אספקת כוח חיצונית שיכול להחיל עד 10V ומגבר הנוכחי, שחסרים את הרגישות ואת מאפייני רעש נמוך ברוחב פס גבוה (kHz 1>) עבור חישת מולקולה בודדת. בעוד ניסויי biomolecular טיפוסיים להסתמך על מגבר הנוכחי רעש נמוך שמוגבל ל ± 1 V, זה פשוט כדי לתכנן מערכת אחת שיכול להשיג את שני אוויר גבוה שדה חשמלי ובמדידה נוכחית רגישה עם adjuרווח יציב. למרות מגבלה זו, המעבר מהגדרה אחת לשנייה הוא מהיר ופשוט. בהשוואה לטכניקות קיימות לשליטה בגודל nanopore כגון השימוש של 5 SEM, חמצון וקרום חיטוב 8 תרמיים, שדות חשמליים גבוהים מציעים מתודולוגיה מהירה יותר, מדויקת יותר ופחות יקרה שניתן לבצע על הספסל במעבדה תוך שימוש בציוד סטנדרטי ומספקות מגוון רחב יותר של גדלי nanopore. היכולת במהירות וreproducibly כדי להפחית את הרעש בתדירות נמוכה גם גורמת ייצור ראשוני אמינה יותר ומאריכה את חייו של nanopores מצב מוצק, כפי שניתן להיבנות נקבוביות שימש בעבר לניסויים נוספים. בסך הכל, מעל 95% מnanopores בעוביים שונים ממוזגים עם שדות חשמליים גבוהים הציגו מאפיין רעש בתדירות נמוכה מעט מאוד, מה שהופך אותם מתאימות לחישת biomolecule. ייצור הוא ובכך קל יותר ואמין יותר, מה שהופך את ניסויי nanopore מצב מוצק accessi יותרble לחוקרים ופוטנציאל המאפשרים לדרך למסחור של טכנולוגיות nanopore דרך תהליכי ייצור חזקים יותר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה, קרן קנדה עבור חדשנות, וקרן מחקר אונטריו. אנו מודים ליו י 'לסיוע בייצור nanopore ואפיון, L. Andrzejewski לדיונים חשובים ותמיכה טכנית, וא' Marziali לעזרה עם תוכנת nanopore ועיצוב מכשור.

Materials

JEM-2100F TEM JEOL Drilling requires 200 kV accelerating voltage
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier Molecular Devices Low-noise voltage and current amplifier
X-Series data acquisition card National Instruments PCI-6351 Interfacing with setup, apply of high electric fields
LabVIEW 2012 software National Instruments Apply voltages, record current, data analysis
Current amplifier Keithley Current amplification during high electric field pulses
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005X Substrate in which nanopores are created
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows Norcada Inc. NT005Z Substrate in which nanopores are created
Silicone elastomer O-rings Marian Chicago HT6135 Punched for sealing the nanopore chip
Ag/AgCl electrodes In Vivo Metric E255
Nitric acid Fisher Scientific 52004P Used for cleaning cells – handle with caution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H323 Used for piranha solution – handle with caution
Sulfuric acid Fisher Scientific A300 Used for piranha solution – handle with caution
Potassium chloride Fisher Scientific P335
HEPES Fisher Scientific BP310 Buffering KCl solution
Primary Faraday cage Shielding nanopore cell, electrodes
Secondary Faraday cage Shielding headstage, electrode wires
Teflon cell To hold nanopore chip and reservoirs
Hot plate VWR Heating piranha solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).
  2. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).
  3. Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
  4. Wu, M. -. Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).
  5. Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302 (2011).
  6. Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).
  7. Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).
  8. Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304 (2010).
  9. Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).
  10. Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501 (2009).
  11. Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23 (40), 405301 (2012).
  12. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101 (2006).
  13. Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).
  14. Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560 (2011).
  15. Wanunu, M., Meller, A. . Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
  16. Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).
  17. Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22 (31), 315101 (2011).
  18. Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101 (2002).
  19. Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105 (2010).
  20. Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).
  21. Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -. Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).
  22. Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).
  23. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).
  24. Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).
  25. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).

Tags

Solid-state NanoporesSingle Biomolecule CharacterizationNanopore FabricationSize ControlLow-noise PerformanceHigh Electric Field PulsesIn Situ EnlargementAqueous EnvironmentReproducibility

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (80), e51081, doi:10.3791/51081 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image