VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte
Summary
Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.
Abstract
Nichtwirt Krankheitsresistenz von Pflanzen gegen bakterielle Erreger wird durch komplexe Verteidigung Bahnen gesteuert. Das Verständnis dieses Mechanismus ist für die Entwicklung von dauerhaften Krankheit-resistente Pflanzen gegen breites Spektrum von Krankheitserregern wichtig. Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-basierte Screening vorwärts Genetik ist ein sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von pflanzlichen Abwehr Gene verleihen Nichtwirtresistenz. Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierte VIGS Vektor ist die effizienteste VIGS Vektor aktuell und wurde effizient genutzt auf endogene Zielgene in Nicotiana benthamiana Schweigen zu bringen.
In diesem Manuskript, zeigen wir eine vorausschauende Genetik Screening-Ansatz zum Schweigen einzelner Klone aus einer cDNA-Bibliothek in N. benthamiana und Bewertung der Reaktion Gen zum Schweigen Pflanzen für kompromittiert Nichtwirtresistenz gegen Nichtwirt Krankheitserreger Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea und X. campestris pv. vesicatoria. Diese bakterielle Pathogene sind ausdrücklich GFPuv Protein entwickelt und ihre grün fluoreszierende Kolonien können mit bloßem Auge unter UV-Licht in den Nichtwirt Pathogen inokulierten Pflanzen gesehen werden, wenn das Schweigen Zielgens in der Vermittlung Nichtwirtresistenz beteiligt ist. Dies erleichtert zuverlässigere und schnellere Identifizierung von Gen-Pflanzen anfällig für Schweigen Nichtwirt Krankheitserreger. Ferner kann aussichtsreicher Kandidat Gen-Informationen durch Sequenzierung der Anlage Geninsert in TRV Vektor bekannt sein. Hier zeigen wir die hohen Durchsatz Fähigkeit VIGS-vermittelte vorwärts Genetik, um Gene in Nichtwirtresistenz beteiligt sind. Etwa kann 100 cDNAs einzeln in etwa zwei bis drei Wochen und ihre Relevanz in Nichtwirtresistenz gegen mehrere bakterielle Erreger Nichtwirt zum Schweigen gebracht werden kann in einer Woche danach untersucht werden. In diesem Manuskript, aufzuzählen wir die einzelnen Schritte in diesem Screening beteiligt. VIGS-vermittelte vorwärts Genetik screening Ansatz kann nicht nur zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz beteiligt, sondern auch auf das Studium Gene verleihen mehreren biotischen und abiotischen Stress Toleranzen in verschiedenen Pflanzenarten verlängert werden.
Introduction
Nichtwirtresistenz ist der Widerstand aller Pflanzenarten gegen Rassen eines bestimmten Erregers 1,2. Dies verleiht breites Spektrum und dauerhafte Resistenz gegen Krankheiten bei Pflanzen 2,3. Allerdings ist der Mechanismus, insbesondere gegen bakterielle Krankheitserreger, nicht gut 4 verstanden. Screening nach Mutanten oder Pflanzen, die zum Schweigen gebracht Kompromiss Nichtwirtresistenz und hohen Durchsatz Transkript-Profiling zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene während Nichtwirtresistenz 5-9 zwei wichtige Ansätze zuvor zum Präparieren bakterielle Nichtwirtresistenz verwendet werden. Weil Nichtwirtresistenz durch einen komplexen Mechanismus (s) 4 mit der Beteiligung vieler Gene, einen hohen Durchsatz funktionellen Genomik für die Gen-Identifizierung gesteuert wird, ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Nichtwirtresistenz Mechanismus (n).
Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS) wurde erfolgreich eingesetzt, um endogenen pflanzlichen SchweigenGene in vielen Pflanzenarten 10,11. Nicotiana benthamiana ist eines der am besten geeigneten Pflanzen für VIGS 10,12 und ihren Entwurf Genomsequenz ist jetzt 13. Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierte VIGS wurde weithin als reverse genetics Werkzeug um Gene in Nichtwirtresistenz 2,4,14 beteiligt zu charakterisieren. Diese VIGS Vektoren und Derivate sind jetzt durch Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, verfügbar http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS auch als Vorwärts Genetik Werkzeug zur Identifizierung von Genen in Pflanzenzellen Immunität 15-17, insbesondere Nichtwirtresistenz 6,18 beteiligt verwendet. Beurteilung überempfindlich Reaktion (HR)-vermittelten Zelltod von Pflanzen gegen ein bestimmtes Pathogen Nichtwirt induziert und die Beurteilung der Krankheit induzierten Zelltod sind zwei wichtige Tests vor allem für identifyin verwendetg anfällig Gen zum Schweigen Pflanzen. Allerdings HR Zelltod werden nur gegen Typ-II Nichtwirt Erreger induziert und nicht gegen die Typ-I Nichtwirt Krankheitserreger 2. Daher können HR-Assays nicht universell verwendet werden, um Nichtwirtresistenz Strategien der Pflanzen zu identifizieren, vor allem gegen breite Palette von Typ-I Nichtwirt Krankheitserreger. Auch dann, wenn teilweisen Verlust Nichtwirtresistenz in einem Gen zum Schweigen Anlage nicht immer Krankheitssymptome 6 und damit Krankheit Scoring nicht zur Identifizierung von Pflanzen beeinträchtigen Nichtwirtresistenz verwendet werden kann führen. Im Gegenteil, der Bewertung des Wachstums von Pathogenen Nichtwirt im Gen stumm Pflanzen ein besseres Verfahren zur Untersuchung der Verlust Nichtwirtresistenz in Gen stumm Pflanzen.
Im Vergleich zu herkömmlichen Wachstumstest 6,19, eine schnellere Methode zur Beurteilung Nichtwirt Bakterienwachstum auf den Gen zum Schweigen Pflanzen können die Zeit verkürzen, für Vorwärts-Genetik Screening erforderlich. Wir bereits berichtet, ein Verfahren zur Beobachtung Bakterienl Wachstum des Pathogens auf Blättern mit dem bloßen Auge unter ultraviolettem (UV) Licht unter Verwendung von Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) 19. In diesem Manuskript wir demonstrieren die Nützlichkeit der GFPuv Ausdruck Nichtwirt bakteriellen Erregern für eine einfache Identifizierung von Gen-Pflanzen, die zum Schweigen gebracht für Nichtwirtresistenz gefährdet sind. Diese Methodik ist genau für die Identifizierung von anfälligen Pflanzen und zugänglich für das Hochdurchsatz-Screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pflanze Immunität begrenzt das Wachstum von Krankheitserregern Nichtwirt und daher wenig oder gar keine grüne Fluoreszenz von Vektor-Kontrolle Anlage emittiert verlässt geimpft mit Nichtwirt Erreger unter langwelligen UV-Licht (3D). Allerdings, wenn ein Gen in Nichtwirtresistenz beteiligt Schweigen gebracht wird, bevorzugen die Gen-Pflanzen Schweigen das Wachstum der Erreger Nichtwirt und grüne Fluoreszenz zu sehen ist (Abbildung 3E). Dies ist das Grundprinzip des Verfahrens in dies…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der Samuel Roberts Edle Foundation finanziert. Autoren danken Mss. Janie Gallaway und Colleen Elles für exzellente Pflanzenpflege und Frau Katie Brown für das Artwork. Wir würden auch gerne Mss danken. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda und Mr. Isaac Greenhut für technische Hilfe bei der Einrichtung dieses Protokoll.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 96-well U-bottom plates | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA) | 35-3077 | |
| 96-pin replicator stainless steel | Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA) | 250520 | |
| High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA) | 6283K50 | Manufacturer ID 95-0127-01 |
| Stuart SC6 colony counter | Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK | SC6PLUS | |
| Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA) | ||
| Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) |
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA) | Custom synthesized | |
| MES, Monohydrate | VWR international (Radnor, PA, USA) | CAS No. 145224-94-8 | |
| Acetosyringone (Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA) | VIS-30 |
References
- Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).
- Mysore, K. S., Ryu, C. -. M. Nonhost resistance: how much do we know. Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).
- Ellis, J. Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture. The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Nonhost resistance against bacterial pathogens: retrospects and prospects. Annual Review of Phytopathology. 51, (2013).
- Lu, M., Tang, X., Zhou, J. -. M. Arabidopsis NHO1 is required for general resistance against Pseudomonas bacteria. The Plant Cell. 13, 437-447 (2001).
- Rojas, C. M., et al. Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways. The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).
- Daurelio, L. D., et al. Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco. Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).
- Moreau, M., et al. EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Ornithine-delta-aminotransferase and proline dehydrogenase genes play a role in non-host disease resistance by regulating pyrroline-5-carboxylate metabolism-induced hypersensitive response. Plant, Cell & Environment. 35, 1329-1343 (2012).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. The Plant Journal. 39, 734-746 (2004).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. New dimensions for VIGS in plant functional genomics. Trends in Plant Science. 16, 656-665 (2011).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato. Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).
- Bombarely, A., et al. A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).
- Sharma, P. C., et al. Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana. Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).
- Baulcombe, D. C. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).
- Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).
- Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -. M., Kang, L., Mysore, K. S. Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast. Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).
- Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. S. Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv. New Phytologist. 174, 212-223 (2007).
- Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A. M., Baulcombe, D. C. Technical Advance: Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. The Plant Journal. 25, 237-245 (2001).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. Journal of General Virology. 80, 2799-2807 (1999).
- Anand, A., et al. Identification and characterization of plant genes involved in Agrobacterium-mediated plant transformation by virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 41-52 (2007).
- Liu, E., Page, J. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant Methods. 4, 5 (2008).
- Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato. J. Vis. Exp. (28), e1292 (2009).
- Peart, J. R., et al. Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).
- Oh, S. -. K., et al. Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco. Planta. 223, 1101-1107 (2006).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K., Kodama, H., Komamine, A. RNAi and Plant Gene Function Analysis. Methods in Molecular Biology. 744, 13-25 (2011).
