JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Published: January 14, 2014
doi:
10.3791/50970
, , ,
1Institute of Anatomy and Cell Biology,Justus-Liebig-University

Summary

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV), alveolar hipoksi akciğer perfüzyonunun ventilasyonla eşleştiği önemli bir fizyolojik olgudur. HPV’ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Burada, 20-100 μm çapındaki murine pulmoner damarların HPV analizi için protokolümüzü açıklıyoruz.

Abstract

Akut alveolar hipoksi, akciğer perfüzyonunu ventilasyonla eşleştirmeye yarayan von Euler-Liljestrand mekanizması olarak da bilinen pulmoner vazokonstriksiyona (HPV) neden olur. Şimdiye kadar, temel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. HPV’ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Bu damar bölümü, akciğer distalinin terminal bir bronşiol kısmı olarak tanımlanan bireysel bir acinus’un kan temini için sorumludur. İntra-acinar arterler çoğunlukla akciğerin bu kısmında bulunur ve izole perifused akciğerlerde pulmoner arter basıncının ölçümü veya diseksiyonlu proksimal pulmoner arter segmentlerinden kuvvet kayıtları gibi yaygın olarak kullanılan bir dizi teknikle seçici olarak ulaşılamaz1,2. Subpleural damarların gerçek zamanlı konfokal lazer tarama lüminesans mikroskopisi ile analizi,3çapı 50 μm’ye kadar olan damarlarla sınırlıdır.

20-100 μm iç çap aralığındaki murin intra-pulmoner arterlerin HPV’lerini incelemek için bir teknik sunuyoruz. Hassas kesim akciğer dilimlerinde (PCLS) kesitli arterlerin videomorfometrik analizine dayanmaktadır. Bu yöntem, alveolar kanalların yanındaki alveolar septa körüklerinde bulunan iç çapı 20-40 μm arasında olan küçük acinar içi arterlerin ve bronşlara ve bronşlara bitişik çalışan 40-100 μm arasında iç çaplara sahip daha büyük acinar öncesi arterlerin vasoreaktivitesinin nicel olarak ölçülmesine izin verir. Uyuşturulmuş ve havalandırılan farelerde subpleural damarların gerçek zamanlı görüntülenmesinin aksine, PCLS’nin videomorfometrik analizi kesme stresinden arındırılmış koşullarda gerçekleşir. Deneysel modelimizde her iki arteriyel segment de %1 O2 ile orta gazlıya maruz kaldığında monofazik HPV sergiler ve hipokside yanıt 30-40 dk sonra kaybolur.

Introduction

Çoğu sistemik vasküler yatakta hipoksi, pulmoner vaskülürdeki hipoksinin neden olduğu vazokonstriksiyona kıyasla vazodilatasyona neden olandır. Düşük oksijen gerilimine akciğere özgü bu yanıta hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV) denir, saniyeler içinde geçer ve normoksik ventilasyona geri döndükten sonra hızlı bir şekilde tersine döner. HPV 60 yıldan fazla bir süredir bilinmesine rağmen, hücresel oksijen sensörleri ve vazokonstriksiyonla sonuçlanan sinyal basamaklamaları hala tartışilmektedir. Hipoksi ile çağrıştırılan redoks ve ROS değişikliklerinin HPV ve pulmoner hipertansiyon gelişimi için gerekli olduğu konusunda göreceli geniş bir fikir birliği vardır (Sylvester ve ark.’da gözden geçirilmiştir). 4 ve Schumacker ve diğerleri. 5). Kendi verilerimiz HPV6,7’demitokondriyal solunum zincirinin karmaşık II’nin merkezi bir rolünü desteklemez. Son zamanlarda, Wang ve ark. oksijen algılama ve HPV için tamamen yeni bir kavram sundu: Verilerine dayanarak, alveolar hipoksinin endotel hücrelerinin membran depolarizasyonuna neden olan bitişik kılcal damarlar tarafından algılanmasını önermektedirler. Yanıt, endotel hücrelerinin konnexion 40 boşluk birleşimleri ile yayılır ve yukarı akış arteriyüllerinin düz kas hücrelerinin daralmasına yol açar8.

Akciğerin atardamarları hava yollarının yanında çalışır, onlarla birlikte dallanma, çapı sürekli azalır ve son olarak alveolar duvarlarda bulunan kılcal sisteme kan sağlar. Bu arteriyel dolaşım anatomik ve fonksiyonel olarak farklı segmentlerden oluşur. Duvarlarda bol miktarda elastik lif ile karakterize proksimal kanal arterlerini, pulmoner vasküler direnci büyük ölçüde kontrol eden tamamen kaslı intra-pulmoner arterler izler. Adım adım, bu arterler kas tabakasının eksik kaldığı segmentlere geçer ve son olarak damarlar düz kas aktüen-immünreaktif hücrelerden arındırılır. Bireysel pulmoner acinus’u kanla besleyen intra-acinar arter kısmen kas segmentini temsil eder6. Aynı şekilde, pulmoner arteriyel sistem hipoksik yanıtla ilgili tekdüze bir yapıyı temsil etmez, ancak bölgesel çeşitlilik9,10olarak işaretlenmiştir. Örneğin, sıçan akciğerlerinden izole edilen proksimal pulmoner arterlerde hipoksi bifazik bir yanıta neden olur ve kısa süreli ilk hızlı kasılma gösterir – eksik gevşemeden sonra – ikinci bir yavaş ama sürekli kasılma11. Sıçan akciğer parenkiminden dördüncü ve beşinci pulmoner arterler (dış çap <300 μm) olarak izole edilen direnç arterlerinde hipoksi monofazik daralmaya neden olur9. Zaten 1971’de Glazier ve Murray, hipoksik gaz karışımlarıyla havalandırılan köpeklerin akciğerlerindeki kılcal kırmızı kan hücresi konsantrasyonundaki değişikliklerin ölçümlerinden, vasküler dirençteki hipoksi kaynaklı artışın esas olarak kılcal damarların yukarı akışında meydana geldiği sonucuna vardı12. Günümüzde, anestezi ve mekanik olarak havalandırılan farelerin sağlam akciğerlerinin intravital mikroskopisi pulmoner mikrovasküler13,14’ünanalizi için güçlü bir aracı temsil eder. Torasik duvardaki dairesel bir pencerenin eksizyonu, akciğer yüzeyine mikroskobik erişim sağlar ve çapı 50 μm’ye kadar olan alt pulmoner damarların analiz edilmesini sağlar. Bu tekniği FITC-dektran infüzyonu ile birleştirerek, Tabuchi ve ark. sadece 30-50 μm çapındaki orta büyüklükteki arteriyoüllerin, 30 dk’dan sonra küçük bir zayıflama ile 60 dakikalık bir süre boyunca devam eden hipoksiye belirgin bir yanıt gösterdiğini göstermiştir. Buna karşılık, 20-30 μm çapında küçük arteriyollar hipoksi3’esadece küçük bir yanıt gösterdi. Bununla birlikte, bu teknik, bu damarlar akciğer dokusunun çok derinlerinde bulunduğundan, 50 μm’den daha büyük çapa sahip arterlerin analizine izin vermez.

Murine akciğerlerin büyük ve çok küçük pulmoner arterlerinin (alt el damarları gibi) analizindeki boşluğu kapatmak için, Martin ve ark. hava yollarının reaktivitesinin analizi için15. Agarose jel aşılama tekniğine dayanarak, bu nispeten yumuşak ve elastik organdan hassas kesilmiş akciğer dilimlerinin (PCLS) hazırlanmasını kolaylaştırır. PCLS içinde iç çapı 20-100 μm arasında olan kesitli arterlerin vasoreaktivitesi doğrudan videomikroskop ile gözlemlenebilir. PCLS’nin hipoksik inkübasyonu sırasında ilaçların uygulanması HPV üzerindeki etkilerinin analizini sağlar. Bu tekniğin genetik olarak tasarlanmış fareye de uygulanabilmesi ayrı bir önem taşımaktadır. Akciğer içindeki konumlarına göre, arterleri sırasıyla 20-40 μm ve 40-100 μm iç çaplarına sahip, acı verici öncesi ve içi damarlar olarak sınıflandırıyoruz. Fonksiyonel bir görünüm altında intra-acinar arter kan ile bireysel bir pulmoner acinus sağlar ve pre-acinar arter önceki damar bölümleridir. Resimlerin dijital kameraya kaydedilmesi, vasoreaksiyonun daha sonra ölçülmesini sağlar. Bu PCLS modelinin belirgin bir özelliği, endotel üzerinde hareket eden kesme stresi eksikliğidir. Buna karşılık, perfüzyonlu damarlarda akut HPV kesme-streste bir artışa yol açar ve böylece NO release16gibi ikincil mekanizmaların indüklendiğini söyler. Ek olarak, PCLS kullanımı, ekstrapulmoner sinirsel veya hormonal etkiler olmadan HPV ölçümlerine izin verir. Hücre kültürü sistemlerinin aksine, örneğin köpek pulmoner arteriyel düz kas hücrelerinden hazırlanan17, damar duvarının histolojik mimarisi neredeyse tamamen korunur.

Özetle, bu protokol, kesme stresinden arındırılmış koşullar altında iç çapları 20-100 μm arasında olan pulmoner arterlerin HPV’lerinden sorumlu potansiyel moleküler oksijen sensörlerinin ve/veya hücresel yolların analizi için yararlı bir yöntem sağlar.

Protocol

1. Gaz Karışımlarının, Ekipmanlarının, Aletlerinin ve Çözümlerinin Hazırlanması Bu bölümde protokol için gerekli donanım ve kurulum açıklanmaktadır. Ek ayrıntılar ve üretici bilgileri eşlik eden tabloda bulunabilir. Aşağıdaki gaz karışımlarını elde edin veya hazırlayın: % 21 O 2, % 5.3 CO2,% 73.7N 2’denoluşan normoksik gaz karışımına sahip iki şişe. % 1 O 2 , % 5.3 CO2,% 93.7 N2’denoluşan hipoksik gaz karışımına sahip bir şişe. Aşağıdaki ekipmanları toplayın:Agarose’un eriti için mikrodalga fırın. Agarose’un akciğer bölümlerinden yıkanması için bir ısıtma kabini (aşağıya bakın). Normoksik gaz karışımı olan bir şişeye bağlı bir tüpü kabine yerleştirin. Akciğerleri 200 μm kalınlığında dilimler halinde kesmek için uygun jiletlere sahip bir vibratom. Vibratom, vibratom havzasındaki tamponu soğutmak için bir soğutma seti ile döşenmişse avantajlıdır. İntrapulmoner arterlerin HPV analizi için ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir akışlı süperfüzyon odası. Akciğer bölümlerinin odanın dibine sabitlenerek sabitlenmesini kolaylaştırmak için naylon telleri platin bir halkaya (kendi kendine inşa edilmiş) bağlayın. Perfüzyon haznesini, sırasıyla 0,7 ml/dk ve 6 ml/dk’ya ayarlanmış akış hızlarına sahip peristaltik bir pompaya birleştirin. Ekipmanı, deneyler sırasında ortam 37 °C’lik bir su banyosunda depolanacak ve 21 G x 4 3/4 kanül kullanılarak normoksik veya hipoksik gazla kabarmış olacak şekilde monte edin. Ayrıca, normoksik/hipoksik gaz karışımlarının perfüzyon odasının hava boşluğuna beslenmesini sağlamak için gaz şişesinden ikinci bir bağlantı kullanın. Bu sistemin tüm tüplerinin gaz geçirmez olduğundan emin olun. Analiz edilen arter görüntülerini kaydetmek için dik ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir CCD kamera. Aşağıdaki enstrümanları hazırlayın: Akciğerlerin hazırlanması için: kaba bir makas ve iki çift forseps içeren steril bir diseksiyon seti, göğsün açılması için ince bir makas, agarose doldurmak için nefes borusuna bir delik kesmek için bir mikros makas ve agarose’un dışarı çıkışını önlemek için nefes borusunun kesilmesi için pamuk (yaklaşık 20 cm) dikmek. Hava yollarının agarose ile doldurulması için: IV indwelling canülün esnek plastik borusuna 2 ml şırınga bağlayın (20 G x 1 1/4). Akciğerlerin tampon ile perfüzyonu için: 50 ml’lik bir şırınnayı fare hazırlığı için çalışma yerinden yaklaşık 40 cm yukarıda bir tampon rezervuarı olarak sabitleyin. Tamponun çıkışı için: şırınnayı 25 G x 1 çanül takılı olan bir tüpe bağlayın. Çıkışı yaklaşık 1 damla / sn ‘ye (yaklaşık 0,3-0,4 ml / dk) ayarlamak için tüpte bir kelepçe kullanın. Aşağıdaki arabellekleri ve ortamları hazırlayın: 1.000 ml HEPES-Ringer tamponu yapın (10 mM HEPES, 136.4 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2.2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glikoz, pH 7.4). Steril filtratlı tamponu (filtrenin gözenek boyutu: 0,2 μm) 4 °C’de saklayın. Akciğerlerin izolasyonu başlamadan yaklaşık 30 dakika önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın: HEPES-Ringer tamponunda (toplam hacim 10 ml) %1,5 w/v düşük erime noktası agarose çözün ve mikrodalga fırında pişirerek eritin. Daha sonra, bir ısıtma kabininde depolayarak 37 ° C’ye kadar soğutin. Agarose’u pulmoner hava yollarına doldurmak için 2 ml şırıngayı önceden ısıtın. HEPES-Ringer tamponunun 20 ml’sini alın, 250 I.U./ml’lik son konsantrasyona heparin ekleyin ve tamponu 37 °C’ye ısıtın. Kullanımdan hemen önce, 75 μM’lik son konsantrasyona sodyum nitroprusside ekleyin. Bu pulmoner vaskültürden kan akması için perfüzyon tamponu. 200 ml HEPES-Ringer tamponu cam bir kabın içine koyun ve buzda saklayın. Bu tampon, agarose dolu izole akciğerlerin soğutulması için gerekli olacaktır. Cam bir kabın içine% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş yaklaşık 200 ml MEM doldurun ve ısıtma kabininde 37 ° C’de saklayın. Ortamı normoksik gaz karışımı ile kabarcıklayın. Bu, agarose’un akciğer bölümlerinden çıkarılması için kullanılacaktır. 37 °C’ye kadar bir su banyosunda% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 2 şişe MEM ve videomorfometrik ölçümlere başlamadan önce en az 2 saat boyunca sırasıyla normoksik ve hipoksik gaz karışımı ile kabarcıklayın. Ölçüm başına yaklaşık 250 ml MEM gerekecektir. Aşağıdaki ek malzemeleri toplayın: Dezenfeksiyon için% 70 EtOH. 4 °C’de depolanan heparin stok çözeltisi (25.000 I.U./5 ml), (yukarıya bakın). NO donör sodyum nitroprusside (Nipruss) stok çözeltisi: H2O’da 10 mM, buz üzerinde saklanır (yukarıya bakın). Tromromboxane analog U46619 stok çözeltisi: Etanolde 10 μM, buz üzerinde saklanır. Süperglue. Agarose ile doldurulduktan sonra nefes borusunun ligasyonu için pamuk dikmek. 2. Hayvanlar 10-25 haftalıkken her iki cinsiyetten fareleri (örneğin C57Bl6 suşu) kullanın. HPV ayrıca nakavt suşlarında ve buna karşılık gelen vahşi tip suşlarda da analiz edilebilir. Tüm deneyler, deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH yönergelerine göre gerçekleştirildi ve yerel kurumsal kurullar tarafından onaylandı. 3. Murine Akciğerlerinin İzolasyonu ve Hassas Kesilmiş Akciğer Dilimlerinin Hazırlanması (PCLS) Servikal çıkık ile fare öldürmek. Öldürdükten hemen sonra, ventral vücut yüzeyini% 70 EtOH ile sterilize edin ve cildi ventral orta hat boyunca çeneden pelvise kesmek için kaba makası kullanın.Not: izofluran gibi inhalatif anesteziklerin damar tonu üzerinde etkisi olduğu bilindiğinden18,19, uçucu anestezikler kullanmayın. Karın boşluğunun açılmasından sonra bağırsak halkalarını bir kenara koyun ve büyük karın damarlarını kanama için kesin. İnce makasla diyaframa nüfuz ettikten sonra, plevral boşluğa hava girişi sonucu akciğerler çökecektir. Diyaframı alt torasik diyaframdan ayırmak için makası kullanın. Rip kafesinin ventral kısmını çıkarmak için kaburgaları ve köprücük kemiğini yanal olarak kesin.Not: Aksi takdirde akciğerlerin agarose ile şişkinliği imkansız olacağından, akciğerlerin bu adımda zarar görmemesi önemlidir! Sadece steril aletler ve laboratuvar camları kullanın. Pulmoner vaskülatın perfüzyonuna başlamadan önce, tamponun boşalması için kalbin sol ventrikülüne küçük bir delik açın. Şırıng rezervuarını heparin ve sodyum nitroprusside (perfüzyon tamponu) içeren sıcak (37 °C) HEPES-Ringer tamponu ile doldurun ve pulmoner vaskülatını sağ ventrikülden yavaşça geçirin.Not: Akciğerler rengini değiştirip beyaz bir görünüme kavuştuğunda perfüzyon etkilidir. Bu adımda perfüzyon tamponuna sodyum nitroprusside eklemek önemlidir; bu, acinar öncesi arterlerin çevre dokudan kopmasını önler. Tükürük bezlerini, küçük kasları ve bağ dokusunu trakeadan çıkarın. Trakeayı çevredeki bağ dokusundan çıkarın ve daha sonra ligasyon için yemek borusu ile trakea arasında pamuk diken iplik. İki komşu trakeal kıkırdak arasında trakeanın üst kısmına küçük bir delik açmak için mikrossörü kullanın. Şimdi bir IV indwelling kanül esnek plastik boruyu küçük delikten nefes borusuna yerleştirin ve dikiş pamuğu ile dikkatlice sabitleyin. Hava yollarını yavaşça ılık (37 °C) düşük erime noktası agarose ile doldurun. Akciğerleri gözlemleyin: İlk başta sağ akciğer genişlemeye başlar ve ardından sol akciğer. Dolgu, her iki akciğer de in vivo durumla karşılaştırılabilir bir hacme şişirildiğinde tamamlanır (cinsiyete, yaşa ve ağırlığa bağlı olarak yaklaşık 1.2-2.0 ml).Not: Sadece bir akciğer genişlerse, plastik boru bronşlara ulaşacak şekilde çok derine yerleştirilmiş olabilir. Bu durumda, biraz çekilmesi gerekiyor. Agarose’un yavaş yavaş soğuduğunda katılasa iyileşeceğini unutmayın. Akciğerler dolduğunda, aynı anda plastik boruyu çekin ve agarose’un dışarı çıkmasını önlemek için nefes borusunu dikiş pamuğu ile bağlayın. Daha sonra, trakeayı ligatürün üstünde kesin ve akciğerleri ve kalbi göğüsten blok halinde ayırın.Not: Yeni başlayanlar için, ligasyon adımında bir meslektaşından destek istemek yararlı olabilir. Agarose katılaştırmak için organ paketini buz gibi HEPES-Ringer tamponuna aktarın. Bu birkaç dakika içinde olur. Tek tek akciğer loblarını ayırın ve vibratomun numune tutucusuna bir lobu süperglue ile sabitleyin.Not: Elastik akciğer dokusunun kesilmesi sırasında eğriltme görevi gören tutucuya bir parça şampanya mantarı yapıştırmak faydalıdır. Kullanılan akciğer lobuna ve numune tutucusuna olan yönelimine bağlı olarak, elde edilen PCLS küçük veya büyük damarların analizi için daha uygun olabilir. Çoğunlukla PCLS’nin hazırlanması için sol lob ve sağ kranial lob kullanıyoruz. Kesitli küçük acınar arterler elde etmek için, kranial sağ lobun hilum ile tutucuya yapıştırın ve çevreden dilimleyin. Kesitli ön-acinar arterleri almak için, sağ lobun hilum’u şampanya mantarı ile hizalayın. Akciğer lobını 200 μm kalınlığında dilimler halinde kesmek için taze jiletle donatılmış bir vibratom kullanın (hız: 12 = 1,2 mm/sn; frekans: 100; genlik: 1,0). PCLS’i 4 °C soğuk HEPES-Ringer tamponu ile dolu vibratom havzasında toplayın.Not: HEPES-Ringer’ın soğutularak kullanılması önerilir. Agarose’un çıkarılması için, organ bölümlerini yaklaşık 200 ml 37 °C sıcak MEM ile dolu bir cam kabın içine aktarın. Kabı, normoksik gaz karışımına sahip bir şişeye birleştirilmiş bir tüpün yerleştirildiği ısıtma kabinine koyun. MEM’i normoksik gazla kabartır, böylece akciğer bölümleri ortamda yavaşça hareket eder. Yaklaşık 2 saat sonra, hava sahalarını dolduran “agarose plakları” akciğer dokusundan çıkarılacaktır. Bu, bölümlerin artık ortamın üstünde yüzmediği, ancak kabın dibine yerleştiği gerçeğiyle tanınabilir. 4. PCLS İntrapulmoner Arterlerinin Videomorfometrik Analizi Pulmoner arterlerin videomorfometrik analizi için, bir PCLS’yi 1.2 ml normoksik gazlı MEM ile dolu akışlı süperfüzyon odasına aktarın. Odanın altındaki PCLS’yi platin halkaya bağlı naylon tellerle sabitleyin (dış/iç çap: 14/10 mm). PCLS’i mikroskobik olarak iç çapları 20-100 μm arasında olan kesitli arterler için tarayın.Not: Arterlerin lümenleri düz endotel hücreleri ile kaplıdır. Çevredeki düz kas hücreleri faz kontrast görüntüsünde lümen çevreleyen bir “koyu halka” olarak tanımlanabilir (Şekil 2’dekifaz kontrast görüntülerine bakın). Buna karşılık, hava yolları, plevral yüzeye giden yolda basit bir sütunlu epitel içine geçen başlangıçta sözde katmanlı sütunlu epitel ve ardından basit bir küboidal epitel ile tanımlanabilir. Her deneyin başındaki iç çapı ölçün.Not: Hafif eğik kesilmiş kaplarda, borulu yapının gerçek iç çapı lümenin en uzun eksenine 90° açıyla belirlenebilir. İç çapları 40 μm > büyük pre-acinar arterler bronşlara ve bronşiollere bitişik olarak çalışır. İç çapı 40 μm <küçük acınar içi arterler, alveolae ve alveolar kanalların yanında alveolar septa körüklerinde bulunur6. Deneysel tasarım: Her deneye, odanın normoksik gazlı ortamla perfüzyona maruz olduğu bir “adaptasyon aşaması” ile başlayın (akış hızı: 0,7 ml/dk; 10 dk). Daha sonra, damarın canlılığını test edin: 10 μM U46619’un 12 μl ilavesi ile atardamarın kontrtilitesini analiz edin (son konsantrasyon 0.1 μM; 10 dk; akış yok).Not: Bu iş için, ışık alanı en az% 30 oranında azaldığında bir kap uygulanabilir olarak tanımlanır (ölçüm yöntemi için aşağıya bakın). İlacı normoksik gazlı orta (akış hızı: 6 ml/dk; 10 dk) ile yıkadıktan sonra, 10 mM Nipruss’un 3 μl’si (son konsantrasyon 25 μM; 10 dk; akış yok) uygulamasıyla arteri genişletin. Yine, ilacı normoksik gazlı orta (akış hızı: 6 ml / dk) ile 10 dakikalık bir yıkama ile çıkarın ve ardından 0.7 ml / dk’lık bir akışta 10 dk. PCLS’nin hipoksik gazlı orta ile inkübasyonu ile hipoksik pulmoner vazokonstriksiyona neden olun (akış hızı: 0.7 ml/dk; 40 dk). Ek bir tüp sistemi ile, hipoksik gaz karışımını perfüzyon odasının hava boşluğuna besleyin. Hipoksik ortamı normoksik gazlı ortamla 20 dakikalık bir yıkama ile çıkarın (akış hızı: 6 ml/dk). Her deneyin sonunda, vazokonstriksiyona neden olmak için perfüzyon odasına 1.2 μl 10 μM U46619 (son konsantrasyon 0.01 μM; 20 dk; akış yok) ekleyin.Not: Bu son adım, hipoksik yanıttaki bir değişikliğin (örneğin hipoksik fazda bir ilacın eşzamanlı olarak uygulanmasıyla veya nakavt fare zorlanmasından hazırlanan bir PCLS’de gözlemlenerek) hipoksi kaynaklı daralmaya özgü olup olmadığının veya kontrtiyak üzerindeki genel bir etkiyi yansıtıp yansıtmadığının belirlenmesine izin verir. 0,01 μM konsantrasyonu, önceki konsantrasyon-kasılma ölçümlerinde tahmin edilen U46619’un EC50 değerine karşılık gelir (yayınlanmadı). Perfüzyon odasının hava boşluğunda hipoksik gazlı MEM ve normoksik gaz karışımı yerine normoksik ile kontrol deneyleri yapmak için başka bir PCLS kullanın. 5. Vasoreaktivitenin Analizi ve Grafik Sunumu Uygun yazılımı kullanarak tüm deney boyunca her dakika kesitli arterden fotoğraf çekin. Uygun yazılım kullanarak, tam ekran resimler kullanarak iç sınırları elle astarlayarak damarların ışıklı alanının değişikliklerini değerlendirin.Not: Net grafikler elde etmek için her saniye resmi analiz etmek yeterlidir. Ancak, akışlı superfusion odasındaki bir koşul diğerine değiştirildiğinde, her resmi analiz edin. Kalan resimler, bir fotoğrafın analiz edilemeyeceği durumlarda yedek görevi görebilirsiniz.Ne yazık ki, bu zaman alıcı adım, ölçüm sırasında hareket eden damar duvarına bazen kan hücreleri takıldığından veya damarın mükemmel bir kesitinde değil, iç sınırların güvenilir bir lokalizasyonunun sadece görsel kontrol altında yapılabileceği teğetsel bir bölüm olduğundan, uygun programlardan değil, elle yapılmalıdır. Deneyin başında damar lümeni alanı için elde edilen değeri 0 olarak tanımlayın ve vazokonstriksiyon veya dilatasyonu bu değerin göreceli düşüşü veya artışı olarak ifade edin. Her deney için uygun yazılımı kullanarak zamana karşı göreli ışık alanını çizin. Birkaç deneyi özetlemek için, ortalamanın (SEM) zamana karşı göreceli parlak alanlarının +/- standart hatasının araçlarını çizin.Not: Çeşitli maddelerin hipoksi veya U46619 kaynaklı pulmoner vazokonstriksiyon veya nakavt fare suşlarının hipoksik yanıtı üzerindeki etkilerinin net bir sunumu için, geminin canlılığının test edildiği deneylerin ilk aşaması grafikten atlanabilir. Bu durumda, azaltılmış oksijene maruz kalmanın başlangıcında elde edilen değerler% 100 olarak tanımlanır. 6. İstatistiksel Analiz Kruskal-Wallis ve Mann-Whitney testi ile deneysel gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin, p≤0.05 önemli ve p≤0.01 oldukça önemli.Not: PCLS’nin hazırlanması ve operasyonel kullanımı hakkında ek bilgi için ayrıca bkz:20,21.

Representative Results

Şekil 1’de büyük bir pre-acinar arterin HPV ölçümünün sonuçları ve küçük asçınar içi arterlerin Şekil 2’sinde verilmiştir. Faz kontrast görüntülerinde (Şekil 1A ve 2A) akciğer dokusu içindeki konumlarına göre bu 2 arter sınıfını ayırt etmenin mümkün olduğu açıktır: Pre-acinar arterler yakın mahallede çalışır bronşlar ve bronşioller (Şekil 1A), oysa intra-acinar arterler alveolar septa körüklerinde bulunur ve alveola ile çevrilidir (Şekil 2A). Biraz pratikle, faz kontrast resimlerinde U46619’a yanıt olarak aydınlık alandaki değişiklikleri görmek mümkündür (Şekil 1A ve 2A). Bununla birlikte, hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon genellikle çok belirgin değildir ve sadece ışık alanlarının değişikliklerinin tam olarak değerlendirilmesinin ardından netleşir(Şekil 1B, 1C, 2B ve, 2C). Didaktik nedenden dolayı, alışılmadık derecede belirgin bir vazokonstriksiyon gösteren bir pre-acinar arter örneği verdik. Ortalama olarak HPV, ışıklı bölgenin -30 oranında azalmasına neden olur. Şekil 2’de, 50 μM pinacidilli veya 50 μM pinacidilsiz hipoksik gazlı ortamla inkübe edilen küçük acinar arterlerin kayıtları gösterilmiştir (mitokondriyal ATP’ye duyarlı potasyum kanallarının seçimsiz bir açıcısı) ve ilacın inhibitör etkisi açıkça görülebilir hale gelir. Deneyin son kısmı ilacın HPV üzerindeki eyleminin seçiciliğini göstermektedir: Tromromboxane analog U46619 tarafından indüklenen vazokonstriksiyon pinacidil ilavesi ile değiştirilmez. Gerçekten de, arter eğrisi pinacidil’in diğer ikisinden belirgin şekilde daha düşük olduğunu ortaya çıkardı, ancak ışık alanının sadece U46619 tarafından azaltılmasının boyutu karşılaştırılabilir. Bu durumda, eğriler arasındaki farka neden olan HPV’nin eksik geri çevrilmesiydi. Bu grafikte ayrıca normoksik gazlı ortama maruz kalan bir arter ek kontrol olarak dahil edilir. Bu durum altında, ışıklı alanda herhangi bir değişiklik tespit edilemez. Şekil 3’te pinacidil’in HPV üzerindeki etkisine ilişkin tüm ölçümler serisinin verileri gösterilmiştir. İstatistiksel farklılıklar için iki grubun karşılaştırılması için, belirtilen zaman noktalarının veri kümeleri Kruskal-Wallis ve Mann-Whitney testi ile analiz edildi. HPV pinacidil varlığında açıkça kaldırılmış, U46619 kaynaklı kasılma değişmemiştir. Alternatif olarak, Müller-Redetzky ve ark.’da açıklandığı gibi eğrinin altındaki alanın karşılaştırılmasıyla gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek mümkündür. 22 Şekil 1. Büyük bir pre-acinar arter hpv ölçümü. (A) Kesitli bir bronş(B)için yakın mahallede çalışan kesitli bir ön-acinar arter (a) faz kontrast görüntüleri. Resimler daireler halinde (B) ile belirtilen zaman noktalarında yapılır: ölçümün başında (a), U46619 (b) ile tedavinin sonunda, Nipruss’a (c) maruz kalmanın sonunda, hipoksik gazlı ortamda (d, e) 30 veya 40 dk’dan sonra, normoksik gazlı ortamla yıkandıktan sonra (f) ve U46619’un son uygulamasından sonra (g). Grafikte (B) ışıklı alanın değişiklikleri zamana göre çizilirken, deneyin başındaki ışık alanı% 100 olarak tanımlanır ve vazokonstriksiyon / dilatasyon göreceli değerler olarak verilir. Bu durumda hipoksi, ışıklı alanın% 60 azalmasına neden oldu. (C) Hipoksik yanıtın daha net bir sunumu için, vazoreaktivitenin test edildiği deneyin başlangıç aşaması dahil değildir, ancak azaltılmış oksijene maruz kalmadan hemen önce elde edilen değer% 100 olarak ayarlanır (ayrıca bkz. Şekil 2). Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. Şekil 2. Pinacidil’in (mitokondriyal ATP’ye duyarlı potasyum kanallarının seçimsiz bir açıcısı; mitoKATP) küçük acınar arterlerin HPV’si üzerindeki etkisi. (A) İntra-acinar arterler (a) alveolar septa körüklerinde bulunur. Alv = alveolus. Bu deneylerde uygulanan bireysel koşulların sırası grafiğin (B) başlığında verilmiştir. Hipoksik maruziyet 50 μM pinacidil varlığında veya yokluğunda gerçekleştirilir. Kontrol inkübasyonları normoksik gazlı ortam ile yapılır. (A)cinsinden gösterilen resimler ölçümün başında (a, a’, a”), tedavinin sonunda U46619 (b, b’, b”), Nipruss’a (c, c’, c”) maruz kalmanın sonunda, hipoksik veya normoksik gazlı ortamda (d, d’, d”; e, e’, e”), normoksik gazlı ortamla (f, f’, f”) yıkandıktan sonra ve U46619’un son uygulamasından sonra (g, g’, g”) 30 veya 40 dk sonra. Normoksi/hipoksi/hipoksi+pinasitede yanıtın daha net bir sunumu için, normoksik/hipoksik gazlı ortama maruz kalmadan hemen önce elde edilen değerler% 100 (C) olarak ayarlanır. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. Şekil 3. HPV’nin pinacidil ile inhibisyonu. 50 μM pinacidilli veya 50 μM pinacidilsiz hipoksik gazlı ortama maruz kalan küçük acınar arterlerin kayıtları özetlenir ve SEM ± araç olarak sunulur. (A)içinde kayıtların tamamı verilir,(B) içinde hipoksik inkübasyonun başlangıcındaki değere ilişkin göreli veriler gösterilir. Pinacidil içeren hipoksik gazlı ortama maruz kalan PCLS’de vasoreaktivite saptenemez. U46619 tarafından indüklenen vazokonstriksiyon ilaç tarafından etkilenmez. Braketlerdeki “n”, PCLS’nin yapıldığı arter sayısını/hayvan sayısını ifade eder. Başka bir deyişle, ilk sayı analiz edilen akciğer bölümlerinin sayısını açıklar ve ikinci sayı bu bölümlerin hazırlandığı farelerin sayısını verir. Verilen zaman noktalarında her iki grup arasındaki farklar önem için test edilir. n.s.: önemli değil, *: s≤0.05, **: p≤0.01, ***: s≤0.001. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. Şekil 4. Yöntemin şematik özeti. Kısaca, fareler servikal çıkık tarafından öldürülür. Göğsün açılmasından sonra, akciğerler düşük erime noktası agarose ile doldurulur ve soğuduktan sonra 200 μm kalınlığında hassas kesilmiş akciğer dilimleri (PCLS) kesilir. Agaroz 37 °C’de çıkarıldıktan sonra bir PCLS, normoksik ortama maruz kaldığı akışlı süperfüzyon odasına veya% 1 O2ile orta gazlıya aktarılır. Vasoreaktivite, ışıklı bölgede değişiklikler olarak kaydedilir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Discussion

İzole havalandırılmış ve perfüzyonlu fare akciğeri, pulmoner vasküler sistemin oksijen kaynağındaki değişiklikler üzerindeki fizyolojik yanıtının analizi için mükemmel bir modeldir ve diğerlerinin yanı sıra pulmoner arteriyel basıncın sürekli ölçümüne izin sağlar1. Bununla birlikte, bu model hipoksiye en güçlü yanıtı gösteren vasküler segmentlerin tanımlanmasına ve analizine izin vermez. Bu, iç çapları 20-100 μm olan bireysel arterlerin HPV’nin ölçülmesine kolaylaştıran PCLS videomorfometrik analizimizin avantajıdır. Hücre kültürü sistemlerinin aksine, tüm hücre tipleri orijinal doku matrisi yapılandırmalarında bulunur. Ayrıca, bir akciğer birçok PCLS’nin hazırlanması için yeterlidir, böylece en azından kısmen deneyler aynı fareden bölümlerin kullanılmasıyla standartlaştırılabilir. Russell ve Burch23’ün 3R konseptine (yaşam bilimlerindeki laboratuvar hayvanlarının azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi) göre, bu gerçek PCLS kullanımını da savunuyor.

Bununla birlikte, örneğin Kübler ve ark. 14 artık mümkün değil.

Başlangıçta, PCLS esas olarak biyokimyasal, farmakolojik ve toksikolojik çalışmalar için uygulanmıştır, ancak bu arada bronş kontraktilitesi, mukoziyel fonksiyon ve vasküler yanıtların ölçümü için de kullanılırlar (incelemeler için bkz: Sanderson20 ve Davies21). Held vd. izole perfüzyonlu ve havalandırılmış fare akciğeri ve PCLS24modellerini karşılaştırdıkları bir çalışma gerçekleştirmişlerdir. Hava yolları ve pulmoner damarların çeşitli endojen mediatörlere verdikleri yanıtların analizi ile tüm akciğerin önemli özelliklerinin PCLS’de korunduğunu buldular.

PCLS’de hipoksik durumlar sağlam akciğerde olduğu gibi hava yolları üzerinden değil, hipoksik gazlı ortamda akciğer bölümünün inkübasyonu ile ortaya çıkarken ortaya çıkarken ortaya çıktı. %1 O 2 ,%5,3CO 2 , %93,7 N2ve%21O2 , %5,3 CO2 , %73,7 N2ile pregazsed ortamın oksijen kısmi basıncını (pO2)bir kan gazı analizörü kullanarak analiz ettik. Perfüzyon odasına beslemeden hemen önce, hipoksik gazlı MEM’in pO2’si 40 mmHg ve normoksik gazlı orta 160 mmHg6idi.  Sağlam akciğerDE HPV, alveolar pO2 50 mmHg25’inaltına düştüğünde indüklenmiştir, hipoksik gazlı ortamın uygulanmasıyla açıkça taklit edilebilen bir durumdur. HPV’nin kapsamına ilişkin verilerimiz, farklı bir deneysel yaklaşımla elde edilen sonuçlarla iyi eşleşir. Yamaguchi ve ark. 20-30 μm çapındaki mikrovesselleri gerçek zamanlı konfokal lazer tarama lüminesans mikroskopisi ile incelemek için izole fare akciğerleri uyguladık, bir görüntü yoğunlaştırıcı10ile yüksek hassasiyetli bir kameraya bağlanmıştır. Akciğerlerin hipoksiye maruz kalmasından sonra çaplarında ortalama 2,7 μm azalma gözlemlediler. Sistemimizde ölçtükçe ışık alanının% 20 azalmasının çapının yaklaşık% 15’ine karşılık geldiği hesaplanabilir.

Deneylerimizde arterleri sırasıyla 40-100 μm ve 20-40 μm iç çaplarına sahip ön ve acinar damarlar olarak sınıflandırdık. İnsanlarda kaslardan nonmüsküler arterlere geçiş 70-100 μm çap aralığında gerçekleşir. Farelerde, düz kas hücreleri 20 μm26dış çapa kadar bulunur. Bu nedenle, çapı 20 μm’nin altında olan arterleri analiz etmek mümkün değildir, çünkü faz kontrast görüntüsüne göre güvenilir olarak tanımlanamaz. Ölçeğin diğer ucunda, çapları 100 μm’nin üzerinde olan damarlar PCLS’de bulmak zordur ve genellikle çevre dokudan çıkarılır.

Aslında, bir dizi moleküler aday moleküler oksijen sensörü(ler) veya HPV ile sonuçlanan sinyal basamaklamanın bir bileşeni olarak tartışılmaktadır (inceleme için bkz. 4). Uygun nakavt fareleri mevcut olduğunda, vahşi tip hayvanlara kıyasla pre-ve intra-acinar arterlerin vasoreaktivitesinin analizi için videomorfometri kullanılabilir. Bununla birlikte, PCLS diğer sorunlar için de kullanılmıştır: Faro ve ark. doğumdan sonra akciğerde endotel bağımlı genişleme gelişimini karakterize etmek için onları istihdam29 ve 2 hafta boyunca günlük duman veya havaya maruz kalan kobaylardan hazırlanan PCLS, endotel disfonksiyonunun indüksiyonu yoluyla sigara dumanının vasoreaktivite üzerindeki etkisini göstermek için kullanılmıştır30.

Protokol içinde kritik adımlar

Deneylerimizde arterleri ön-acinar (40-100 μm iç çapları) ve intra-acinar (20-40 μm iç çaplar) olarak sınıflandırdık. Özellikle daha büyük damarların analizi için kullanılması gereken akciğer bölümlerinin hazırlanması için perfüzyon tampona sodyum nitroprusside eklenmesi önemlidir. Bu ilaç, numune hazırlama sırasında damarların kasılmasını ve böylece eksik vazodilasyona yol açan çevre dokudan koparılmalarını önler. Perfüzyon tamponundaki sodyum nitroprusside, alveolar septaya güçlü bir şekilde tutturuldukları için küçük arterlerin analizi için kullanılması gereken akciğer bölümünün hazırlanması için çok önemli değildir.

Tüm deneyler arterlerin reaktivitesinin test edildiği inkübasyonlarla başlatılmalıdır. Nadiren, gemilerin yüklenicilere veya dilatörlere hiçbir yanıtının tespit edilemeyen akciğer preparatları elde ettik. Bunun nedenini bilmiyoruz: Akciğerlere doldurulan agarose hacminin çok büyük veya çok düşük olması olabilir, böylece organın PCLS’ye kesilmesi optimal değildi. Alternatif olarak, agarose’un aşılama prosedürü sırasında çok hızlı soğuduğu ve kesme stresine zarar verdiği düşünülebilir. Tek bir PCLS’de uygulanabilir bir arterin tespit edilememeyen bir durumda, bölümün atılması ve başka bir arterle değiştirilmesi gerekir.

Bir atardamarın uygulanabilirliğine ilişkin karar U46619’a verilen yanıta dayanarak verildi. U46619’un 0,1 μM konsantrasyonda uygulanması, bazı egzersizlerden sonra doğrudan ekrandaki görüntü dizisinde görülebilen bir vazokonstriksiyona neden oluyor. Vasoreaktivitede bazı farklılıklar olduğundan, ilaca maruz kalan akciğer bölümlerindeki vasoresponseyi ölçerek veya sırayla sadece ortama bir ilacın HPV üzerindeki etkisini araştırıyoruz.

Bireysel bir arterin HPV’si genellikle mikroskopta neredeyse hiç tespit edilemez ve ortalama olarak yaklaşık% 20-30’luk ışık alanının azalmasına neden olur. Bununla birlikte, bir arterin çapındaki küçük değişiklikler akış direnci üzerinde belirgin bir girişe sahiptir. R=direnç ve r=radius ile “R = 1/r4” denklemine göre, akış direnci yarıçapın dördüncü gücüyle ters orantılıdır. Bir örnek vereyim: 40 μm (r=20 μm) çapında dairesel bir kesit sergileyen “ideal arter” yaklaşık 1.260 μm2ışık alanına sahiptir. Işıklı alan % 20 azaldığında, geminin çapının% 10,5 oranında azaltılarak 35,8 μm’ye (r=17,9 μm) düşürüldüğünü hesaplayabiliriz. Yukarıda verilen denkleme göre, bu geminin akış direnci 6.25 x 10-6’dan 9.71 x 10-6’ya yükselecekti, bu da yaklaşık% 55’tir. Işıklı alanın% 30 azaltılması durumunda yarıçap yaklaşık% 16 azalır, ancak akış direnci yaklaşık% 100 artar. Bu hesaplamalar, laminer bir kan akışının ve sert bir borunun damar formunun, çapın zaten küçük değişikliklerinin akış direnci üzerindeki etkisini düşündürücü olduğu varsayılabilen bir aşırı basitleştirme olmasına rağmen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Excellence Cluster Kardiyo-Pulmoner Sistemi tarafından desteklenmektedir.

Materials

Vibratome "Microm HM 650 V" Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany
Microwave oven Bosch, Frankfurt, Germany HMT 702C
Heating cabinet Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany
Flow-through superfusion chamber  Hugo Sachs Elektronik, March, Germany PCLS-Bath Type: 847 SN:4017
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives  Leica, Wetzlar, Germany
CCD-camera  Stemmer Imaging, Puchheim, Germany
Peristaltic pump Minipuls 3 Gilson, Limburg-Offheim, Germany
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 9452450
Gas tight tubes Tygon R3603-13      Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in VWR, Darmstadt, Germany
Various scissors and forceps
Sewing cotton
2 ml Syringe  Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml Syringe Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany 4254112B For instillation of the agarose into the lung
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany 4665643 For bubbling of the medium
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm  Terumo, Eschborn, Germany NN 2425 88DSF18 For lung perfusion
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) Linde, Hildesheim, Germany
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) Linde, Hildesheim, Germany
HEPES Sigma, Deisenhofen, Germany H 4034
NaCl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.1
KCl Merck, Darmstadt, Germany  1.04936.0500
MgCl2•6H2O Merck, Darmstadt, Germany  1.05833.0250
CaCl2•2H2O Merck, Darmstadt, Germany  1.02382.0500
Glucose D-(+) Sigma, Deisenhofen, Germany G 7021
Low melting point agarose  Bio-Rad, Munich, Germany 161-3111
Heparin-sodium Ratiopharm, Ulm, Germany 5120046
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 5120046
70% EtOH for desinfection Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany
Superglue UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket
U46619 (a thromboxane analog) Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 538944
Sodium nitroprusside (Nipruss) Schwarz Pharma, Monheim, Germany 5332804
Optimas 6.5 software  Stemmer, Puchheim, Germany
SPSS 19 AskNet,  Karlsruhe, Germany
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).
  2. Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor. J. Physiol. 536, 211-224 (2001).
  3. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).
  4. Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. Hypoxic pulmonary vasoconstriction. Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).
  5. Schumacker, P. T. Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).
  6. Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).
  7. Paddenberg, R., et al. Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries. Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).
  8. Wang, L., Yin, J., et al. Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction. J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).
  9. Archer, S. L., Huang, J. M., et al. Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and. 78, 431-442 (1996).
  10. Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis. Circ. Res. 82, 722-728 (1998).
  11. Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia. Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).
  12. Glazier, J. B., Murray, J. F. Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion). J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).
  13. Bhattacharya, J., Staub, N. C. Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung. Science. 210, 327-328 (1980).
  14. Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).
  15. Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
  16. Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs. J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).
  17. Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).
  18. Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium. J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).
  19. Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung. Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).
  20. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
  21. Davies, J. . Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook. , 57-68 (2012).
  22. Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice). PLoS One. 7 (5), (2012).
  23. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Universities Federation for Animal Welfare. , (1959).
  24. Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. Characterization of airway and vascular responses in murine lungs. Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).
  25. Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis. Thieme Verlag. , 198-19 (2009).
  26. Will, J. The Pulmonary Circulation. in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).
  27. Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice. Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).
  28. Wright, J. L., Churg, A. Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices. J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).

Tags

Videomorphometric AnalysisHypoxic Pulmonary VasoconstrictionIntra-pulmonary ArteriesMurine Precision Cut Lung SlicesIntra-acinar ArteriesPre-acinar ArteriesVasoreactivityAlveolar HypoxiaVon Euler-Liljestrand MechanismPulmonary PerfusionVentilation Matching

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (83), e50970, doi:10.3791/50970 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image