マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析

1. 混合ガス、機器、機器、およびソリューションの製造 このセクションでは、プロトコルに必要な装置とセットアップについて説明します。追加の詳細と製造元の情報については、付属の表を参照してください。 以下の混合ガスを入手または準備します。 21%O2、5.3%CO2、73.7%N2からなるノルモキシガス混合物を含む2本のボトル。 1%O2、5.3%CO2、93.7%N2から構成される低酸素ガス混合物を含む1本のボトル。 以下の機器を集める:電子レンジ、アガロースを溶かします。 肺切片からアガロースを洗い流す加熱キャビネット(下記参照)。ノルモキシ性ガス混合物を含むボトルに接続されたチューブをキャビネットに挿入します。 200 μm の厚さのスライスに肺を切断するための適切なカミソリの刃とビブラートメ。ビブラートメのバッファーをビブラート盆地で冷却するために、冷蔵セットが備え付けられている場合に有利です。 肺動脈のHPVの分析のために、逆顕微鏡に取り付けられたフロースルーの多重注入室。 チャンバーの底部への肺切片の固定を容易にするために、白金リング(自己構築)にナイロンの糸を接続する。灌流チャンバを、流量がそれぞれ0.7 ml/minと6 ml/minに調整された蠕動ポンプに加わります。 実験中に媒体が37°Cの水浴に貯蔵され、21 G x 4 3/4カヌラを使用してノルモキシ性または低酸素ガスで泡立たされるように装置を組み立てます。さらに、ガスボトルからの第2の接続を使用して、ノルモキシ/低酸素ガス混合物を灌流チャンバの空域に供給できるようにします。このシステムのすべてのチューブがガスタイトであることを確認します。 分析した動脈の画像を記録するために直立反転顕微鏡に取り付けられたCCDカメラ。 次の機器を準備します。 肺の準備のために:粗いはさみと2組の鉗子を含む無菌解剖セット、胸部を開くための細かいはさみ、アガロースを充填するための気管に穴を開けるマイクロシザー、およびアガロースの流出を防ぐために気管の結紮のための綿(約20cm)を縫製する。 アガロースで気道を充填する場合:IVの留置カニューレ(20 G x 1 1/4)の柔軟なプラスチックパイプに2mlの注射器を接続します。 バッファを持つ肺の灌流のために:マウスの準備のための作業場所の上に約40cmの緩衝液貯留として50mlシリンジを固定する。 バッファーの流出の場合:25 G x 1 カニューレが取り付けられているチューブにシリンジを接続します。チューブのクランプを使用して、流出を約1ドロップ/秒(約0.3〜0.4 ml/分)に調整します。 次のバッファとメディアを準備します。 1,000 ml HEPES-Ringer バッファー (10 mM HEPES, 136.4 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2.2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM グルコース, pH 7.4)滅菌濾液(フィルターの細孔サイズ:0.2 μm)を4°Cに保存します。 肺の隔離を開始する約30分前に、次の解決策を準備します。 HEPES-Ringerバッファー(総体積10ml)に1.5%w/v低融点アガロースを溶解し、電子レンジで調理して溶かします。その後、加熱キャビネットに保管して37°Cまで冷却します。肺気道にアガロースを充填するための2mlシリンジを前温め。 HEPES-Ringerバッファーを20mlとし、ヘパリンを250 I.U.mlの最終濃度に加え、バッファーを37°Cに加熱します。 使用直前に、ニトロトルシドナトリウムを最終濃度75μMに加えます。これは、肺血管系から血液を流し落とす灌流バッファーです。 ガラスビーカーに200mlのHEPES-Ringerバッファーを入れ、氷の上に保管します。このバッファーはアガロースで満たされた孤立した肺を冷却するために必要とされる。 ガラスビーカーに1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補った約200mlのMEMを充填し、加熱キャビネットの37°Cで保管してください。培地をノルモキシ性ガス混合物で泡立てろ。これは、肺の切片からアガロースの除去に使用されます. MEMのプレウォーム2ボトルは、37°Cに水浴中の1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補い、ビデオモルフォメトリック測定を開始する前に少なくとも2時間、ノルモキシ性および低酸素性ガス混合物でそれらを泡立てる。測定ごとに約250mlのMEMが必要です。 以下の追加資料を収集します。 70% 消毒のためのEtOH. ヘパリンのストック溶液(25.000 I.U./5 ml)を4°C(上記参照)で保存。 NOドナーニトロプルシドナトリウム(ニプルス)のストック溶液:10 mMをH2Oで、氷上に保存する(上記参照)。 トロンボキサンアナログU46619のストック溶液:エタノール中の10 μM、氷の上に保存。 スーパーグルー。 アガロースで充填した後の気管の結紮のための綿を縫う。 2. 動物 10-25週齢で両方の性別のマウス(例えばC57Bl6株)を使用する。HPVは、ノックアウト株および対応する野生型株でも分析することができる。 すべての実験は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従って行われ、地元の機関理事会によって承認されました。 3. ネズミの肺の分離と精密切断肺スライスの調製(PCLS) 頸部脱臼でマウスを殺す。殺した直後に、70%のEtOHで腹側体表面を殺菌し、粗いはさみを使用して顎から骨盤に腹側正中線に沿って皮膚を切断する。注:イオブルランなどの吸入麻酔薬は血管のトーン18,19に影響を与えるのが知られているので、揮発性麻酔薬を使用しないでください。 腹腔の開口後、腸管ループを脇に置き、出血のために大きな腹部の血管を切断する。細かいはさみで横隔膜を貫通した後、胸膜腔への空気の侵入の結果として肺が崩壊する。はさみを使用して、下胸部開口から横隔膜を取り外します。肋骨と鎖骨を横に切り、裂け目ケージの腹側部分を取り除きます。注:そうでなければアガロースで肺の膨満感が不可能になるので、このステップでは肺が損傷しないことが重要です!滅菌器具と実験室用ガラス製品のみを使用してください。 肺血管系の灌流を開始する前に、緩衝液の排出のために心臓の左心室に小さな穴を切断する。ヘパリンとニトロトルシドナトリウム(灌流バッファー)を含む暖かい(37°C)HEPESリンガーバッファーでシリンジ貯留層を充填し、右心室を介して肺血管系をゆっくりと浸透させる。注:肺が色を変え、白い外観を得るとき、灌流は効率的です。このステップでは、灌流バッファーにニトロトルシドナトリウムを追加することが重要です;これにより、周囲の組織から前の静脈動脈が剥がれ落ちるのを防ぎます。 唾液腺、小さな筋肉、および気管から結合組織を取り除きます。周囲の結合組織から気管を切り離し、後で結紮のために食道と気管の間で綿を縫う糸。 マイクロシザーを使用して、隣接する2つの気管軟骨の間の気管の上部に小さな穴を切り込みます。今、気管に小さな穴を介してIV内留カニューレの柔軟なプラスチックパイプを挿入し、慎重に縫製綿でそれを修正します。ゆっくりと暖かい(37°C)低融点アガロースで気道を満たします。肺を観察する:最初は右肺が拡大し始め、次いで左肺が続く。両方の肺が 生体内 の状況に匹敵する体積(性別、年齢、体重に応じて約1.2〜2.0 ml)に膨らむと、充填が完了します。注: 1つの肺しか膨張しないと、プラスチックパイプが深く挿入されすぎて気管支に届くことがあります。この場合、少し引き出す必要があります。アガロースは徐々に冷え込むと固化します。 肺が満杯になったら、同時にプラスチックパイプを引き出し、縫製綿で気管を揚げ、アガロースの流出を防ぎます。その後、合字の上の気管を切断し、胸から ブロック上の 肺と心臓を取り外します。注: 初心者の方は、同僚にライゲーションステップでサポートを依頼すると役に立つ場合があります。 臓器パケットを氷冷HEPES-リンガーバッファーに移してアガロースを固める。これは数分以内に発生します。 個々の肺ローブを分離し、ビブラートの標本ホルダーにスーパーグルーで1つのローブを固定します。注:弾性肺組織の切断中にスキューバックとして機能するホルダーにシャンパンコルクの一部を貼り付けるのが役立ちます。使用される肺のローブに応じて、そして、試料ホルダーのその向きに、得られたPCLSは、小さいか大きい血管の分析に適しているかもしれません。主に、PCLSの調製には左葉と右頭蓋葉を使用します。架隔された小さな口腔内動脈を得るためには、頭蓋右葉をひもでホルダーに接着し、周囲からスライスします。交差した前のアシナル動脈を得るためには、右葉のヒラムをシャンパンコルクに合わせます。 新鮮なカミソリの刃を装備したビブラートを使用して、肺の葉を200μmの厚さのスライス(速度:12 = 1.2 mm/sec;周波数:100;振幅:1.0)に切ります。4 °Cの冷たいHEPES-リンガーバッファーで満たされたビブラーム盆地でPCLSを収集します。注: HEPES リンガーの冷却は推奨されますが、必須ではないです。 アガロースを除去するために、約200 ml 37°Cの温かいMEMで満たされたガラスビーカーに器官のセクションを移す。ノーモキシ性ガス混合物を含むボトルにチューブが結合した加熱キャビネットにビーカーを入れます。肺切片が培地内でゆっくりと動いるように、MEMをノルモキシ性ガスで泡立ててください。約2時間後、空域を満たす「アガロースプラーク」は肺組織から除去される。これは、セクションが媒体の上に泳がなくなり、ビーカーの底に落ち着いているという事実によって認識することができます。 4. PCLSの肺内動脈のビデオモルフォメトリクス解析 肺内動脈のビデオモルフォメトリクス解析では、1.2 mlノルモキシガスを充填したフロースルースーパーフュージョンチャンバーに1つのPCLSを移す。白金のリングに接続されたナイロンのひもで部屋の底にあるPCLSを固定します(外/内径:14/10ミリメートル)。 PCLSを顕微鏡でスキャンし、内径が20~100μmの断面動脈を探します。注:動脈の内腔は平らな内皮細胞によって並んでいます。周囲の平滑筋細胞は、位相コントラスト画像において、内腔を囲む「暗いリング」として識別することができる( 図2の位相コントラスト画像を参照)。対照的に、気道は、胸膜表面に向かう途中で単純な柱状上皮に続いて単純な立方体上皮に移る最初の擬似層状柱上皮によって同定することができる。 各実験の開始時に内径を測定します。注: わずかに斜めに切断された容器では、管状構造の真の内径は、内腔の最も長い軸に対して90°の角度で決定することができます。内径>40μmの大きな前口動脈は、気管支と気管支に隣接して走る。内径<40μmの小さな口腔内動脈は、肺胞管と肺胞ダクト6の隣にある歯槽セプタのガセットに位置しています。 実験設計: 各実験を開始し、チャンバーにノルモキシ性ガスを浸透させた「適応段階」(流量:0.7 ml/分、10分)で行います。次に、血管の生存率をテストする:10 μM U46619(最終濃度0.1 μM;10分;流れなし)の12 μlを添加して動脈の収縮性を分析します。注:この作業では、発光領域が少なくとも30%減少すると、船舶は生存可能と定義されます(測定方法については下記参照)。 ノルモキシ性ガス化培地(流量:6ml/分;10分)で薬剤を洗浄した後、10mMニプルス(最終濃度25μM;10分;無流量)の3μlを塗布して動脈を拡張する。 再度、ノルモキシ性ガス媒体(流量:6 ml/分)で10分洗浄し、その後0.7ml/分の流量で10分洗浄して、薬物を除去する。 低酸素性ガス媒質(流量:0.7 ml/分;40分)でPCLSをインキュベーションすることにより、低酸素肺血管収縮を誘導する。追加のチューブシステムにより、低酸素ガス混合物を灌流チャンバの空域に供給する。 ノルモキシガスを用いた培地(流量:6ml/分)で20分洗浄して低酸素培地を取り除きます。 各実験の最後に、10 μM U46619 (最終濃度 0.01 μM; 20 分; 流量なし) の 1.2 μl を灌流チャンバに加えて、血管収縮を誘導します。注: この最終ステップでは、低酸素反応の変化(例えば、低酸素相での薬物の同時適用によって誘発されるか、ノックアウトマウス株から調製されたPCLSで観察される)が低酸素誘発収縮に特異的であるか、または収縮に対する一般的な影響を反映しているのかを決定することができます。0.01 μMの濃度は、以前の濃度収縮測定で推定されたU46619のEC50値に相当します(公表されていません)。 灌流室の空域で低酸素ガスMEMとノルモキシ性ガス混合物の代わりにノルモキシ性の制御実験を行うために別のPCLSを使用してください。 5. 血管反応性とグラフィック表示の分析 適切なソフトウェアを使用して、全体の実験中に毎分断面動脈から写真を撮ります。 適切なソフトウェアを使用して、全画面写真を使用して手で内側の境界を裏打ちすることによって、血管の発光領域の変化を評価します。注:明確なグラフを得るために、毎秒画像を分析するだけで十分です。しかし、フロースルースーパーフュージョンチャンバー内の1つの条件が別の条件に変更された場合は、すべての画像を分析します。残りの写真は、1枚の写真が分析できない場合のバックアップとして機能します。残念ながら、この時間のかかるステップは、時には血液細胞が測定中に移動している血管壁に取り付けられているか、血管の完全な断面ではなく、内側の境界の信頼できる局在化が視覚的な制御下でのみ行うことができる接線セクションであるため、適切なプログラムによってではなく、手作業で行われなくてはなりません。 実験開始時に血管管腔の面積に対して得られた値を100%と定義し、この値の相対的な減少または増加として血管収縮または拡張を発現する。 各実験のために、適切なソフトウェアを使用して時間に対して相対的な明るさ領域をプロットする。 いくつかの実験を要約すると、時間に対する平均(SEM)の相対発光領域+/-標準誤差の平均をプロットします。注:低酸素症またはU46619誘発性肺血管収縮またはノックアウトマウス株の低酸素応答に対する様々な物質の影響の明確な提示のために、実験の初期段階は、血管の生存率が試験される、グラフから省略することができる。この場合、還元された酸素への曝露の開始時に得られた値は100%と定義される。 6. 統計分析 Kruskal-Wallis-とMann-Whitney検定を用いた実験群の違いを分析し、p≤0.05は有意であると考えられ、p≤0.01は非常に有意であると考えられる。注: PCLS の準備および操作上の使用に関する追加情報は、20,21も参照してください。