Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Le thymus est l'organe dans lequel le développement des cellules T se produit. Sa taille relative et absolue diminue avec l'âge quand il est remplacé successivement par de la graisse bien que l'activité du thymus peut encore être détecté dans la vieillesse. Son importance pour la réponse immunitaire a été démontrée dans le début des années 1960 ^1.

Le répertoire des cellules T est façonnée par l'interaction des récepteurs des cellules T avec des complexes peptide-MHC sur les différents types de thymus APC, qui assurent la survie ou la mort des indices de développement de cellules T, ce qui entraîne un répertoire fonctionnel et largement auto-tolérance des lymphocytes T ^2.

Environ 98% des cellules dans le thymus humain développent des lymphocytes T appelés thymocytes. Les 2% restants se composent d'un certain nombre de différents types de cellules, y compris une variété de TEC (corticale, médullaire, sous-capsulaire), myéloïde et CD plasmacytoïdes (MDC, PDC), les macrophages, les lymphocytes B, les cellules matures re-circulation T, les granulocytes, faibroblasts, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales de très rares avec un phénotype d'expression qui ressemble à celle des cellules provenant d'autres tissus tels que les muscles, les neurones et de l'épithélium des voies respiratoires (Figure 1). Parmi ceux-ci, TEC et DC sont les principaux types d'APC présents dans un thymus normal. Au cours des dernières années, la purification de ces types d'APC pour la culture et le profilage moléculaire a gagné de plus en plus d'intérêt. En raison de leur basse fréquence, l'isolement de l'un de ces types de cellules pour une analyse détaillée nécessite une procédure efficace, reproductible et économique. La méthode présentée ici est une modification d'études publiées antérieurement ^3,4.

Comme avec n'importe quel autre tissu, l'extraction des cellules du thymus peut être obtenue en décomposant par voie enzymatique de la cellule-cellule et les réseaux d'interactions cellule-matrice, pour obtenir une suspension de cellules uniques. Il existe certains paramètres comme la bonne efficacité de dissociation, le rendement cellulaire, la viabilité des cellules et le maintien des cellules smarqueurs de urface qui sont cruciales et doivent être optimisées pour l'isolement réussi de ces populations de cellules rares.

Dans ce protocole, l'isolement des sous-ensembles de DC et TEC est réalisée par formation d'une suspension à cellule unique du tissu par rupture mécanique et la digestion enzymatique. Nous utilisons la collagénase A de Clostridium histolyticum, qui a un rapport équilibré des différentes activités enzymatiques, à briser le collagène natif qui détient le tissu ensemble. DNase I est inclus dans la solution enzymatique pour réduire l'agrégation cellulaire en raison de l'ADN libre à partir de cellules mortes (thymocytes sont très sensibles). Nous fournissons également une approche alternative à la digestion du tissu enzymatique typique impliquant un traitement de tissu mécanique et enzymatique assistée par un dissociateur de tissu. La suspension cellulaire unique est ensuite soumis à une centrifugation unique de densité Percoll pour l'enrichissement de la fraction de faible densité (LDF) de cellules. A partir de cette fraction de cellules, DC peut être isolé par coloration fou marqueurs DC-surface (c.-à-CD11c ⁺⁾ et en utilisant une séparation magnétique ou une cellule activé par fluorescence (FACS). A la différence des cellules lymphoïdes comprenant la grande majorité des cellules dans le thymus, les TEC n'expriment pas CD45 à des niveaux élevés, mais sont positifs pour le adhésion cellulaire épithéliale molécule EpCAM. Ctec peut être distingué du TEC médullaire par l'expression d'un antigène reconnu non encore défini par le CDR-2 (cortical dendritique réticulocytes-2) un anticorps ^{de 4,5} et l'expression d'EpCAM un peu plus faible. L'écart-co-expression de EpCAM et CDR2 permet l'isolement efficace de ces sous-ensembles de TEC par l'intermédiaire de la cellule à grande vitesse de tri ^6.

Le protocole présenté ici est optimisée pour les tissus du thymus humain. La durée de la procédure dépend de la quantité de tissu et de la capacité de l'expérimentateur, ainsi que la vitesse du trieur de cellules, si tri FACS est utilisé. Normalement, le protocole pour l'isolement de CC peut être achevée dans un délai de 5-6 H et à l'isolement des TEC en 8-10 heures. L'isolement des DC et des sous-ensembles de TEC de tissu thymique est sensible au temps. Plus la procédure d'isolement, meilleure est l'état des cellules. Enfin, les cellules isolées peuvent être utilisées pour d'autres investigations, comme des études comparatives de l'ARNm et l'expression des protéines, des expériences de PCR, l'isolement de la protéine, le profilage moléculaire (à savoir les transcriptomique, micro-analyse de l'ARN), ainsi que la culture de la cellule ^6.

Déclaration d'éthique

Afin d'être en mesure de travailler avec le tissu de thymus humain, le chercheur doit obtenir l'approbation du comité d'éthique local ou les autorités responsables ainsi que d'un consentement écrit du donneur (ou habituellement ses parents, puisque le tissu est généralement obtenu à partir de mineurs les enfants). En outre, tous les tissus humains doivent être traités comme étant potentiellement infectieux et des mesures appropriées doivent être prises, telles que le travail avec des gants, etc.