Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

De thymus is het orgaan waarin T cel ontwikkeling optreedt. De relatieve en absolute omvang afneemt met de leeftijd als het achtereenvolgens wordt vervangen door vet hoewel thymus activiteit nog kan worden gedetecteerd in de ouderdom. Het belang van de immuunrespons aangetoond in de vroege jaren 1960 ^1.

De T-cel repertoire wordt gevormd door de interactie van T-celreceptoren met peptide-MHC complexen op verschillende soorten thymus APC, die leven of dood cues de ontwikkeling T-cellen, wat resulteert in een functioneel en grotendeels zelfverdraagzaam T cel repertoire ^2.

Ongeveer 98% van de cellen in de humane thymus ontwikkelen T genoemd thymocyten cellen. De resterende 2% bestaat uit een aantal verschillende celtypen, waaronder een verscheidenheid van TEC (corticale, medullair, subcapsulaire), myeloïde en plasmacytoïde DC (mDC PDC), macrofagen, B cellen, volwassen re-circulerende T-cellen, granulocyten, fibroblasts, endotheelcellen en zeer zeldzame epitheliale cellen met een expressie fenotype lijkt op die van cellen van andere weefsels zoals spieren, neuronen en respiratoire epitheel (figuur 1). Van deze, TEC en DC zijn de belangrijkste APC soorten gevonden in een normale thymus. In de afgelopen jaren is de zuivering van deze APC types voor cultuur en moleculaire profiel kreeg meer en meer belangstelling. Door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen voor gedetailleerde analyse vereist een efficiënt, reproduceerbaar en kosten-effectieve procedure. De hier gepresenteerde methode is een wijziging van eerder gepubliceerde studies ^3,4.

Zoals bij andere weefsels, kunnen cellen extractie uit de thymus worden bereikt door enzymatisch opsplitsing van de cel-cel en cel-matrix interacties netwerken, om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen te verkrijgen. Er zijn bepaalde parameters, zoals goede dissociatie efficiëntie, celopbrengst, leefbaarheid en behoud van cellen en celurface markers die cruciaal zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor de succesvolle isolatie van deze zeldzame celpopulaties.

In dit protocol wordt isolatie van DC en TEC subsets uitgevoerd door een enkele celsuspensie van weefsel door mechanische verbreking en enzymatische digestie. We gebruiken Collagenase Een van Clostridium histolyticum, die een uitgebalanceerde verhouding van verschillende enzym activiteiten heeft, af te breken de inheemse collageen, dat het weefsel bij elkaar houdt. DNase I is in de enzymoplossing naar cel aggregatie te verminderen door vrij DNA van dode cellen (thymocyten zijn zeer gevoelig). We hebben bovendien een alternatieve benadering van de typische enzymatische digestie weefsel met mechanische en enzymatische weefselbehandelelektrode bijgestaan ​​door een weefsel Dissociator. De celsuspensie wordt dan onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugatie voor verrijking van lage dichtheid fractie (LDF) cellen. Van deze fractie van de cellen, kan DC door kleuring f worden geïsoleerdof DC-oppervlaktemerkers (bijvoorbeeld CD 11 c ⁺⁾ en met behulp van magnetische scheiding of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). In tegenstelling tot de lymfoïde cellen die de meeste cellen in de thymus, hoeft TEC CD45 niet tot expressie op een hoog niveau, maar positief voor de epitheliale cel adhesie molecuul EpCAM. CTEC kunnen worden onderscheiden van medullaire TEC door de expressie van een toch ongedefinieerde antigeen herkend door de CDR-2 (corticale dendritische reticulocyten-2) antilichaam ^4,5 en iets lager EpCAM-expressie. De differentiële co-expressie van EpCAM en CDR2 maakt de efficiënte isolatie van deze TEC subsets via high-speed celsortering ^6.

De hier gepresenteerde protocol geoptimaliseerd voor menselijke thymus weefsel. De duur van de procedure is gebaseerd op de hoeveelheid weefsel en het vermogen van de experimentator en de snelheid van de cel sorteerder als FACS sortering wordt gebruikt. Normaal gesproken kan het protocol voor de isolatie van DC binnen 5-6 Uur en voor de isolatie van VEG 8-10 uur. De isolatie van DC en TEC subsets van thymusweefsel is tijd gevoelig. Hoe sneller de isolatieprocedure, hoe beter de toestand van de cellen. Tenslotte kunnen de geïsoleerde cellen worden voor verder onderzoek als vergelijkende studies van mRNA en eiwitexpressie PCR experimenten eiwitisolatie, moleculaire profiel (dwz transcriptomics, micro RNA-analyse) en celkweek ^6.

Ethiek Verklaring

Om te kunnen werken met menselijke thymus weefsel moet de onderzoeker om goedkeuring te verkrijgen van de lokale ethische commissie of de verantwoordelijke overheden als een geïnformeerde schriftelijke toestemming van de donor (of meestal zijn of haar ouders, omdat weefsel wordt meestal verkregen uit minderjarig kinderen). Bovendien moeten alle menselijke weefsels worden behandeld als potentieel infectieus en passende maatregelen moeten worden genomen, zoals het werken met handschoenen, etc.