V3 سير العمل خالية من وصمة عار لمراقبة عملية ومريحة وموثوق بها مجموع البروتين تحميل في النشاف الغربية
Summary
سير العمل V3 هو إجراء لطخة الغربية باستخدام المواد الهلامية خالية من وصمة عار. تسمح التكنولوجيا الخالية من البقع للباحثين بتصور جودة فصل البروتين ، والتحقق من كفاءة النقل ، والأهم من ذلك ، التحقق من صحة التغيير في البروتين المثير للاهتمام باستخدام التحديد الكمي الكلي للبروتين كتحكم موثوق به في التحميل.
Abstract
البقعة الغربية هي تقنية مختبر مفيدة جدا ومعتمدة على نطاق واسع ، ولكن تنفيذها صعب. غالبا ما يوصف سير العمل بأنه “صندوق أسود” لأن التجريبي لا يعرف ما إذا كان قد تم تنفيذه بنجاح حتى آخر عدة خطوات. وعلاوة على ذلك، يتم تحدي جودة البيانات الغربية بسبب عدم وجود أدوات فعالة لمراقبة الجودة في جميع أنحاء عملية النشاف الغربية. هنا نحن نصف سير العمل الغربي V3 ، الذي يطبق تقنية خالية من البقع لمعالجة المخاوف الرئيسية المرتبطة ببروتوكول البقع الغربية التقليدية. هذا سير العمل يسمح للباحثين: 1) لتشغيل هلام في حوالي 20-30 دقيقة. 2) لتصور نوعية فصل العينة في غضون 5 دقائق بعد تشغيل هلام؛ 3) لنقل البروتينات في 3-10 دقيقة. 4) للتحقق من كفاءة النقل كميا؛ والأهم من ذلك 5) للتحقق من صحة التغيرات في مستوى البروتين من الفائدة باستخدام مجموع البروتين تحميل التحكم. هذا النهج الجديد يلغي الحاجة إلى تجريد وإعادة مسحة لبروتينات التدبير المنزلي مثل β أكتين، β-توبولين، GAPDH، الخ سير العمل V3 خالية من وصمة عار يجعل عملية لطخة الغربية أسرع وشفافة وأكثر كمية وموثوق بها.
Introduction
لطخة الغربية هي تقنية مفيدة جدا9، ومع ذلك ، هناك تحديان رئيسيان مع النشاف الغربي : عملية طويلة وكثيفة العمالة وجودة البيانات. بروتوكول التقليدية يتطلب حوالي 2 أيام. وهو ينطوي على العديد من الخطوات بما في ذلك إعداد العينة ، صب الجل ، البروتين الكهربائي ونقله ، حجب الأغشية يليه حضانة الأجسام المضادة ، والتصوير ، وفي كثير من الأحيان تجريد ، إعادة التجريد ، وأخيرا تحليل البيانات. طوال هذه العملية، لا توجد أدوات موثوقة ومرنة للتحكم في العملية. على هذا النحو، يمكن إدخال الأخطاء في كل خطوة، وهذه الأخطاء لديها القدرة على توليد البيانات الفنية؛ لذلك، عناصر تحكم التحميل ضرورية في النشاف الغربية لتحديد وتصحيح الأخطاء. عادة ما يتم التحكم في التحميل عن طريق التحقق من مستوى البروتين المرجعي في كل عينة لمعرفة ما إذا كان يتم تقديمه بالتساوي. الناس غالبا ما تستخدم بروتينات التدبير المنزلي، مثل β-أكتين، β-توبولين، GAPDH، والتحكم في التحميل.
تعتمد جودة بيانات البقع الغربية على التحكم الموثوق في التحميل. ولكن هناك شاغلان مشروعان عند استخدام بروتينات التدبير المنزلي لضوابط التحميل: 1) غالبا ما يكون التخميل المناعي القائم على الأجسام المضادة لعصابات بروتين التدبير المنزلي مشبعا وبالتالي لا يمكن للمرء التمييز بين اختلافات التحميل بينالعينات 30؛ 1) 2) قد يختلف مستوى التعبير البروتين التدبير المنزلي في العينات في ظل ظروف تجريبية معينة ، على سبيل المثال ، علاج سيرنا ، موت الخلية ، تمايز الخلية ، الخ11،28،3،6،10،21. وبسبب هذه المخاوف، تشترط المجلات العلمية الآن أنه “من أجل المقارنات الكمية، ينبغي استخدام الكواشف المناسبة والضوابط وطرق التصوير ذات نطاقات الإشارات الخطية” (المبادئ التوجيهية للطبيعة). وبالمثل، المحررين من مجلة التحقيق السريري يطلبون ضوابط تحميل أكثر موثوقية24. لهذه الأسباب، يحتاج بروتين التدبير المنزلي إلى التحقق من صحته من أجل استخدامه كتحكم في التحميل. أولا ، يجب على المرء التأكد من أنه يقاس في النطاق الديناميكي الخطي لطريقة التقييد المناعي14،29. ثانيا، على المرء أن يتأكد من التعبير عنها باستمرار في جميعالعينات 26,31,25,19,20.
الحل البديل للتحكم في التحميل الموثوق به هو استخدام قياس البروتين الكلي من البقعة. وقد لطخت بعض الباحثين البقع مع بقع البروتين الكلي، مثل كوماسي، فلامنغو بينك، سيبرو روبي، أميدو الأسود، بونسو S، والتكنولوجيا الخالية من البقع، لقياس إشارة البروتين الكلي في كل حارة كما التحكم في التحميل16،20،13،27،1،4،12. التحكم في تحميل البروتين الكلي يتجنب المزالق المرتبطة بروتينات التدبير المنزلي. أولا، هو انعكاس حقيقي لكمية البروتين المحملة لكل عينة. ثانيا، وصمة البروتين الكلية معارض ممتازة مجموعة ديناميكية خطية في نطاق التحميل المشترك لتحليل لطخة الغربية (10-50 ميكروجرام بروتين من lysate خلية معقدة) ويميز بدقة الفرق التحميل بينالعينات 12.
التكنولوجيا الخالية من البقع هي طريقة جديدة لتلطيخ البروتين الكلي حيث يتم خلط مركب فريد من نوعه في محلول هلام الأكريلاميد ويتم توزيعه بالتساوي في الجل المصبوب. بعد اكتمال الكهربائي، يتعرض الجل للأشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن دقيقة واحدة بحيث يتفاعل مركب البقع مع بقايا التربتوفان في البروتين. تصبح البروتينات مثيرة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لإعطاء إشارة فلورية قوية يمكن تصورها وقياسها كميا في صور ممكنة خالية من البقع مثل نظام ChemiDoc MP. ومع ذلك، فإن المركب الخالي من البقع نفسه لا يمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية، مما يؤدي إلى خلفية منخفضة لصورة الجل. تعديل بقايا التربتوفان لا رجعة فيه ويمكن تصور البروتينات ليس فقط في الجل ولكن أيضا على وصمة عار في أي وقت بعد نقل البروتين.
يتم تطبيق التكنولوجيا الخالية من البقع في سير العمل الغربي V3 (الشكل 1) لمعالجة الشكاوى الرئيسية حول سير العمل التقليدي ، وخاصة المخاوف المتعلقة باستخدام بروتينات التدبير المنزلي كعناصر تحكم في التحميل. باستخدام هذا سير العمل، يمكن للمرء أن: 1) تشغيل هلام في حوالي 20-30 دقيقة، 2) التحقق من سلامة العينة وجودة فصل البروتين في 5 دقائق بعد تشغيل هلام. 3) نقل البروتينات في 3-10 دقيقة. 4) التحقق من كفاءة النقل كميا؛ و 5) والأهم من ذلك، التحقق من صحة التغيرات في مستوى البروتين من الفائدة باستخدام مجموع البروتين تحميل التحكم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول V3 خالية من وصمة عار المذكورة أعلاه هو لمتعددة النشاف الفلورسنت الغربية. ويمكن أيضا أن تطبق في النشاف الغربية باستخدام الكشف chemiluminescent. في بروتوكول لطخة الفلورسنت الغربية متعددة ، يتم الحصول على صور البقع الخالية من البقع في نقطتين زمنيتين: 1) مباشرة بعد نقل البروتين؛ 1) بعد نقل البروتين مباشرة؛ 1) بعد نقل البروتين مباشرة. 2) في خطوة التصوير الفلوري متعددة بعد حضانة الأجسام المضادة. يتم استخدام الصورة الأولى الخالية من البقع لحساب كفاءة النقل ويتم استخدام الصورة الثانية الخالية من البقع كتحكم في التحميل. عندما يتم تطبيق طريقة chemiluminescent، فإنه ليس من الممكن أن تأخذ صورة متعددة للإشارات البروتين خالية من وصمة عار والهدف، لأن إشارة chemiluminescent سوف تظهر في قناة خالية من وصمة عار أيضا. في هذه الحالة، نوصي باستخدام الصورة الخالية من البقع التي تم التقاطها مباشرة بعد خطوة نقل البروتين لتحميل التحكم وتحليل التطبيع.
يوفر سير العمل الغربي V3 الفوائد الفريدة التالية مقارنة بسير العمل الغربي التقليدي الذي يستخدم بروتينات التدبير المنزلي كعناصر تحكم في التحميل:
أولا، يوفر سير عمل V3 تحكم تحميل عملي ومريح وأكثر موثوقية للتحقق من صحة التغييرات في مستوى البروتين ذي الاهتمام. يستخدم بروتوكول V3 التحكم الكامل في تحميل البروتين لتطبيع مستوى البروتين الذي يتم قياسه في كل عينة. فإنه يتجنب اثنين من المزالق من استخدام البروتينات التدبير المنزلي كضوابط التحميل: التشبع المناعي ومستويات التعبير عن البروتين التدبير المنزلي غير متناسقة بين العينات في ظل ظروف تجريبية معينة. لم تعد خطوات تجريد وإعادة التجعيد بالأجسام المضادة الموجهة ضد التدبير المنزلي ضرورية. باستخدام التكنولوجيا الخالية من البقع ، ليست هناك حاجة لتلطيخ وإزالة وصمة عار مع بقع مثل Coomassie أو Sypro Ruby لقياس البروتين الكلي. يستغرق بضع ثوان فقط للحصول على صورة لطخة وحوالي 5 دقائق للقيام تطبيع البروتين الكلي باستخدام برنامج مختبر الصور.
ثانيا، يسمح سير عمل V3 للعلماء بالتحكم بشكل أفضل في الإجراء الغربي لأنه يجعل الإجراء أكثر شفافية ويدخل العديد من نقاط التفتيش لمراقبة الجودة. بمساعدة التكنولوجيا الخالية من البقع ، يمكن للباحثين تصور عينات البروتين الخاصة بهم على كل من الجل والبقعة. يمكن للعلماء تقييم سلامة عينة البروتين (المتدهورة أم لا)، ونوعية الفصل (عجلت أم لا)، وكفاءة النقل وجودة النقل (حتى نقل أم لا). تساعد نقاط التفتيش هذه الأبحاث على إنهاء التجربة عند رؤية عيوب كبيرة في العملية وتجنب إضاعة الوقت على العينات والبقع الفقيرة. هذه التكنولوجيا تساعد أيضا العلماء على تقييم ما إذا كان هناك كمية كبيرة من فقدان البروتين بعد تجريد الغشاء وما إذا كانت وصمة عار مناسبة ل reprobing هدف مختلف 4.
إليك بعض النصائح لضمان خبرة جيدة وبيانات ذات جودة عالية باستخدام سير العمل الغربي V3.
- صورة هلام مباشرة بعد تشغيل هلام. لا نقع الجل في أي عازلة قبل التصوير الأول في الإجراء لأنها قد تغسل المركب وصمة عار.
- استخدم نفس منطقة التصوير للحصول على كافة الصور في البروتوكول. وهذا سيسمح للبرنامج لتراكب الصور لتحليل البيانات مثل تطبيع البروتين الكلي.
- حافظ على وقت التعرض ثابتا عند تصوير المواد الهلامية السابقة للتحويل والمواد الهلامية اللاحقة للنقل. وهذا سيسمح للبرنامج بقياس كفاءة النقل كميا.
- الحفاظ على الغشاء الرطب مع بضع قطرات من الماء أو TBST عند الحصول على صورة لطخة. وهذا سوف تجنب المشاكل الخلفية القذرة المحتملة للكشف عن البروتين الهدف.
- استخدام منخفضة الفلورسنت PVDF غشاء لمتعددة النشاف الفلورسنت الغربية.
من المهم ملاحظة أن جزيء خالية من وصمة عار بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية لا رجعة فيه ملزمة بقايا التربتوفان. هذا التعديل لا رجعة فيه قد تؤثر على التعرف على مستضد عند استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة إذا كان الظهارة يحتوي على التربتوفان. من غير المرجح أن تتأثر الأجسام المضادة متعددة النسيلة لأنها تتعرف على عدة أسطح على المستضد. يتم غسل الجزيئات الخالية من البقع غير المنضمة بسهولة من الجل والغشاء وبالتالي لن تتداخل مع التفاعلات المضادة للمضاد.
في الختام، سير العمل الغربي V3 يجعل عملية لطخة الغربية أسرع وأكثر شفافية وكمية وأكثر موثوقية. يمكن للباحثين الآن بسهولة تطبيق التحكم الكامل في تحميل البروتين في تجربة لطخة غربية لجعل بياناتهم أكثر جدارة بالثقة. وقد اعتمد سير العمل V3 خالية من وصمة عار من قبل عدد من المختبرات، ومنشوراتها أظهرت أن المجلات تقبل البيانات الخالية من البقع والتحكم في التحميل في لطخةالغربية 22،17،7،8،5،23،18،15.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور وولف ديتر ستالز، والدكتور آرنو ريمي، والدكتور أنطون بوش، والدكتورة باتريشيا بياتي، وتوم ديفيز، وكريس سيموني، وجيف ديربان على مراجعتهم النقدية وتحريرهم لهذه المخطوطة. كما يشكر المؤلفون أليسون شوارتز على الدعم التقني.
Materials
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |
References
- Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
- Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
- Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
- Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
- Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
- Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
- Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
- Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
- Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
- Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
- Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
- Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
- Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
- Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
- Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
- Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
- Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. . Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
- Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
- Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
- Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
- Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
- You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).
