تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em> في المختبر</em> صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ
Summary
في المختبر يتم تطوير نماذج الصدمة إصابات الدماغ إلى إنتاج في الجسم الحي تشوه الدماغ. واستخدمت الإصابة تمتد الناجم عن الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الأبهر، والخلايا البطانية الدماغ. ومع ذلك، يستخدم نظامنا حاجز الدم في الدماغ (BBB) النموذج الذي يمتلك خصائص تشكل نموذجا المشروعة للBBB إلى إنشاء نموذج في المختبر TBI.
Abstract
ويرجع ذلك إلى ارتفاع معدل الوفيات الحادثة التي نجمت عن إصابات في الدماغ (TBI)، والطرق التي من شأنها أن تمكن واحد لفهم أفضل للآليات الأساسية التي ينطوي عليها ذلك هي مفيدة لتلقي العلاج. هناك على حد سواء في والمجراة في المختبر الأساليب المتاحة لهذا الغرض. في الجسم الحي النماذج يمكن أن تحاكي إصابة في الرأس الفعلي كما يحدث خلال المصرف التجاري العراقي. ومع ذلك، في الجسم الحي تقنيات قد لا يتم استغلالها لدراسات علم وظائف الأعضاء على مستوى الخلية. وبالتالي، في أساليب المختبر هي أكثر فائدة لهذا الغرض نظرا لأنها توفر سهولة الوصول إلى الخلايا والبيئة خارج الخلية للتلاعب.
يقدم بروتوكول لدينا نموذج في المختبر من TBI باستخدام الإصابة تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة. فإنه يستخدم الضغوط التي مورست على الخلايا المستزرعة في آبار مرنة القاع. الضغوط التي مورست يمكن بسهولة أن يسيطر ويمكن ان تنتج الاصابة التي تتراوح من منخفضة إلى شديدة. في الفئرانالدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) ولدت في المختبر لدينا هو نموذج مناسبة تماما للحاجز الدم في الدماغ (BBB) وبالتالي توفير ميزة لغيرها من النظم التي تستخدم تقنية مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لبساطة الأسلوب، يتم تكرار بسهولة التجريبية مجموعة عمليات. وهكذا، وهذا النموذج يمكن استخدامه في دراسة الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في المصرف التجاري العراقي في BBB.
Introduction
إصابات في الدماغ (TBI) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تتأثر حوالي 10 مليون شخص سنويا من قبل المصرف التجاري العراقي مما يجعلها صحية كبيرة ومشكلة طبية 1. ونتيجة لهذا، ومختلف في الجسم الحي ونماذج في المختبر من TBI وأنشئت وتطورت لدراسة آلياتها 2،3،4. فهم أفضل من TBI يمكن أن تساعد على تحسين علاج المريض وتقلل من الوفيات المرتبطة بها، اعتلال، والتكلفة.
نماذج كثيرة لإصابات الدماغ التي تستخدم على حد سواء في والمجراة في المختبر أساليب الوجود. في النماذج الحية يمكن أن تحاكي الحدث الفعلي من إصابة في الرأس. ومع ذلك، ونظرا لتعقيد الوضع في الجسم الحي، وسهولة الوصول إلى الأنسجة من الاهتمام ويصبح محدودا 2. في فهم الاستجابة الفسيولوجية من الخلايا الفردية نتيجة للإصابة وقعت، فمن المهم أن يتم عزل الخلايا من التأثيرات الشاملة التيقد تمنع أو تغيير استجابتهم الفردية 5. لهذا السبب، ونماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6.
في أنظمة المختبر التي توظف استخدام حمولة الميكانيكية إلى الخلايا أو الأنسجة لتحديد التعديلات التي تسببها مثل هذه الطريقة من الإصابة وقد وضعت. على سبيل المثال، تم تأسيس طريقة لدراسة تأثير الإصابة الميكانيكية إلى الخلايا النجمية ل، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 7،8،9. في المختبر نموذج الصدمة التي أنشئت لدراسة القوارض والقابلية للتفاعل نجمية الإنسان 10 يعمل جهاز التحكم في ضغط متطابقة إلى ما نستخدمه لنموذجنا. تم تطبيق نفس الأسلوب للحث على الإصابة من خلال تمتد في الدماغ microvessel الخلايا البطانية الماوس (bEnd3) 11 والخلايا العصبية القشرية 12،13 وكذلك، endoth الدماغيخلايا الخنازير الليل من الأطفال حديثي الولادة 14. الجهاز بتشوهات الجزء السفلي من ثقافة جيدا وبالتالي إنتاج الميكانيكية إصابة تمتد 10. أنه يلحق الضرر على الخلايا المستزرعة من تطبيق ضغط الهواء فوق الخلايا. هذا الضغط يمكن أن يصرف الغشاء الذي على الخلايا تنمو، وبالتالي تمتد الخلايا. ويمكن تحقيق درجات مختلفة من التمدد (أي "منخفض" المعتدلة "، أو" خطير ") عن طريق تحديد مدة النبضة الضغط الجوي وكثافة وفقا لذلك. ارتبط هذا الأسلوب من الإصابة التي يسببها تمتد مع الإصابات في الجسم الحي 7. علاوة على ذلك ، وهذه الطريقة من الإصابة يسمح لمراقبة دقيقة من البيئة خارج الخلية ويمكن بسهولة أن تتكرر.
على الرغم من أن نهج مماثل قد استخدمت للعديد من أنواع خلايا الدماغ الأخرى بما في ذلك bEnd3، نموذجنا هو مزية من حيث أنه يجعل من استخدام الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الفئران (cEND) التي تم إنشاؤهافي المختبر لدينا. هذا خط الخلية هو نموذج مناسبة تماما من حاجز الدم في الدماغ (BBB). في مزارع الخلايا في المختبر تستخدم كنماذج BBB ينبغي أن تمتلك الخصائص التي تمكنها لتكون بمثابة شاشة النفاذية. أحد المعايير الهامة لفي نموذج الخلية المختبر ليكون مؤشرا من BBB نفاذية هو أنه ينبغي أن تمتلك بنية الخلية من الناحية الفسيولوجية واقعية 15. على الرغم من bEnd3 الخلايا عرض مميز المغزل شكل يشبه الحرشفية في الثقافة 16، أنهم يظهرون سلوكا التخلق غير النظامية في المختبر حيث أنها تشكل تجاويف تشبه الكيس بدلا من تركيبات أنبوبية العادية في الليفين المواد الهلامية 17. وعلاوة على ذلك، عندما تم حقن الخلايا الجنينية في الفئران والأطفال حديثي الولادة، والتي يسببها تزايد بسرعة الأورام المميتة على الفئران الجنينية ولكن ليس في الفئران حديثي الولادة وصغار. وبالتالي اقترح أن العمليات التي تحكم واحد أو أكثر طبيعي البطانية النمو، والهجرة، والتمايز قد تم تعديلها أو eliminatإد في هذا الخط الخلية 18. من ناحية أخرى، تظاهر المورفولوجية والتقييم immunocytochemical من قياسات التدفق البطانية وBBB التعبير علامة، الكهربيولوجي، وparacellular أن لدينا نموذج BBB cEND هو في الواقع نموذج مناسب من BBB 19.
يتميز البطانة الدماغ في الجسم الحي من قبل نفاذية ضيق للغاية مع المقاومة الكهربائية عبر البطانية (طير) تتراوح بين 2،000-5،000 Ωcm 2. لدراسات الدماغ خصائص الحاجز الأوعية الدموية الدقيقة لصيدلة، ينبغي النظر التقييد paracellular وضيق من الخلايا. في معظم الدماغ الخلايا البطانية الشعرية (BCEC)، وهذا لا يتم الاحتفاظ باسم خلايا المعرض طير تتراوح 50-100 Ωcm 2 20. وخلد الدماغ البطانية خلية bEnd3 خط يولد القيم طير من لا يزيد عن 60 Ωcm 2 15. في المقابل تمايز الخلايا cEND مع المتوسط تحتوي خفض العرض المصلالقيم طير تتراوح 300-500 Ωcm 2 19،21.
حتى الآن، نماذج في المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ النادرة. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف الخلايا البطانية الدماغ التي تكون بمثابة نموذج للBBB قد تكون مفيدة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم نموذج في المختبر يمكن أن تحاكي التأثير الفعلي أن خلايا الدماغ، وتحديدا الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة من BBB، تتلقاه خلال المصرف التجاري العراقي. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أن كمية من إصابة تطبيقها على خلايا وكذلك بيئة خارج الخلية يمكن السيطرة عليها بسهولة بطريقة دقيقة مما يتيح سهولة استنساخ التجريبية انشاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد درس تأثير الإصابة الميكانيكية في المختبر، وأنشئت طرق الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 8، 9، 22. هناك، ومع ذلك، لا يزال حتى الآن لا يعرف في نموذج المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ. نماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف خلايا المخ البطانية التي تكون بمثابة نموذج من حاجز الدم في الدماغ (BBB) مثل ما يعرض بروتوكول لدينا قد تكون مفيدة.
هذا البروتوكول يجعل من استخدام الخلايا cEND، وهو نموذج BBB أنشئت في المختبر لدينا. منذ غالبا ما تم توثيقه BBB انهيار في المرضى الذين يعانون المصرف التجاري العراقي TBI وغالبا ما يرتبط اختلال BBB الذي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل وذمة 23، 24، وطريقة بريهented هنا على وجه التحديد قد يمكن استخدامها في إجراء الدراسات BBB فيما يتعلق TBI.
في هذا النموذج، فمن المهم أن تأخذ الرعاية من مدى يتم تطبيق درجة الإصابة تمتد إلى الخلايا. في بقدر ما يصابون الخلايا في أي حال، وأيا كان مع كمية الضغط يتم تطبيقها، ودرجة الإصابة التي يمكن أن تؤثر الخلايا البطانية تختلف كثيرا كثيرا من أنواع الخلايا الأخرى. الخلايا البطانية الأبهر هي أكثر مقاومة للإصابة تمتد من الخلايا النجمية أو الخلايا الدبقية المختلطة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها إصلاح بسرعة أكبر بعد الإصابة بالمقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى. لذلك، للخلايا البطانية الدماغ، الخلايا cEND خاصة، أكبر كمية من الإصابة تمتد اللازمة لإنتاج على درجة عالية من الاصابة. يمكن للمرء تحقيق الدرجة المطلوبة من الإصابة من خلال تطبيق ضغط المقابلة مبين في الجدول 1. لخلايا cEND، ومع ذلك، ويفضل إصابة شديدة بسبب مقاومتهم للتوتر. أظهرت فحوصات أجريت LDHكما أن درجة زيادات تمتد، ويفرز أكثر LDH في طاف. في المقابل، فإن الخلايا التي أعطيت كمية قليلة من الإصابة تمتد أنتجت LDH في مبلغ مماثل للسيطرة على الخلايا. كما ورد في البروتوكول، يجب على المرء الحرص على أن يتم استخدام كمية مناسبة من المتوسط منذ زيادة أو نقصان في كمية متوسطة قد يؤدي إلى اختلافات في الضغط الذروة تطبيقها على الآبار. على سبيل المثال، تحتوي كذلك 5 مل من السوائل يسجل ذروة الضغط في المتوسط من 4.0 رطل بينما بئر فارغة يسجل بمتوسط 3.8 رطل عندما يتم تطبيق الضغط 45 رطل لكل بوصة مربعة. لذا، فمن الأفضل لدفع الزناد عدة مرات على مدى التحكم بشكل جيد للتأكد من أن الضغط الذروة التي سيتم إنشاء يتوافق مع المبلغ المطلوب.
في تجاربنا استخدمنا الجدوى وصمة عار لتحديد تأثير تمتد إلى نفاذية غشاء الخلية. البصريات من لوحات ثقافة مرنة ذات قاع كنا تمكننا من السادسEW الخلايا الملون مباشرة تحت المجهر. ومع ذلك، عندما يريد أحد لإجراء دراسات immunolabelling مباشرة بعد تمتد الإصابة، قد تنشأ صعوبات. أولا، قد يكون حجم وسمك لوحة تمثل مشكلة مع بعض منصات العرض المجهر. ثانيا، قد البصريات من غشاء مرن من البئر يكون عائقا لمسح المشاهدة.
على الرغم من القيود المذكورة آنفا، ومع ذلك، فإن الإجراء الموضح يمكن استخدامها كنموذج للفي المختبر إصابة الميكانيكية للBBB. إصابات في الدماغ (TBI) ينطوي على عنصرين، وهما نقص تروية والصدمة. يمكن أن يحدث نقص التروية واصابة الثانوية بعد TBI في الحالات عندما يكون هناك فقدان الدم الخطيرة الناتجة في انخفاض ضغط الدم أو نتيجة لتورم الدماغ تقييد امدادات الاوكسجين الى الدماغ. وتعتبر على أنها تأخر، والضرر غير آلي تمثل العمليات المرضية متتالية بدأت في لحظة إصابة 25. حدوث نقص الأكسجة علىأي fter حادة إصابات في الدماغ هو 26 مشترك. الحرمان الجلوكوز الأكسجين (OGD) هو الأسلوب المستخدمة حاليا إلى نموذج نقص التروية في المختبر. وبالتالي، إخضاع الخلايا لOGD بمثابة إهانة الثانوية إلى الخلايا بعد امتداد يمكن أن تحاكي وقوع TBI يليه نقص التروية. وبالتالي، لتحسين موقعنا الحالي في نموذج المختبر من TBI ونمط ذلك في أقرب وقت ممكن إلى TBI الفعلية كما يحدث في الجسم الحي، في المستقبل سوف تستخدم أيضا OGD في تركيبة مع إصابة التمدد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، المؤسسة الألمانية للبحوث) تحت رقم المنحة FO 315/4- والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241778 إلى CF.
Materials
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
| Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
| Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
| Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
- Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
- Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
- Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. Experimental traumatic brain injury. Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).
- Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
- Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
- Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
- Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
- McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
- Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
- Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
- Berrout, J., Jin, M., O’Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
- Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
- Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
- RayChaudhury, A., Frazier, W., D’Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
- Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
- Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. A cell culturemodel of the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).
- Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
- Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).
