Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel
Summary
Wir entwickelten ein in vitro-Modell, das eine wichtige Komponente der akuten Entzündungsreaktion während der Infektion der Blase mit uropathogenen Escherichia coli nachahmt. Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay erlaubt die quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen Migration über Blasen Epithelien auf lässigen Träger kultiviert, in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktiven Stoffen.
Abstract
Die Rekrutierung von Immunzellen von der Peripherie zum Ort der Entzündung ist ein wesentlicher Schritt bei der angeborenen Immunantwort zu jedem Schleimhautoberfläche. Während der Infektion der Harnblase, polymorphkernige Leukozyten (PMN; Neutrophile) wandern aus dem Blutkreislauf zu durchqueren und die Blase Epithel. Nicht Infektion in Abwesenheit einer Antwort neutrophilen beheben zeigt die Bedeutung der PMN in der Blase Verteidigung. Zur Besiedlung der Blase Epithel, uropathogenen Escherichia coli (UPEC) zu erleichtern, der Erreger der Mehrheit der Harnwegsinfektionen (HWI), dämpfen die akute Entzündungsreaktion mit einer Vielzahl von teilweise definierten Mechanismen. Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Wirt und Bakterien-Pathogen, ein in vitro-Modell von diesem Aspekt der angeborenen Immunantwort zu UPEC entwickelten wir. In der transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test, eine Variante der Boyden-Kammer, kultivierte Blase epithElial Zellen gezüchtet werden, um auf die Unterseite eines durchlässigen Träger Konfluenz. PMN aus menschlichem venösem Blut isoliert und zur basolateralen Seite der Blase epithelialen Zellschichten aufgebracht. PMN-Migration, das die physiologisch relevante basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktive Moleküle mit einer Zählkammer gezählt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen UPEC und eukaryontischen Zellen zu untersuchen sowie die molekularen Anforderungen für die Durchquerung von Blasen Epithelien von PMN abzufragen. Die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Modell wird unser Verständnis der Anfangs entzündliche Reaktion auf UPEC in der Blase zu fördern.
Introduction
Die Bewegung der Zellen im gesamten Körper, oft über lange Strecken, für Wachstum und Entwicklung, Wundheilung, Immunantwort und erforderlich. Zellmigration ist komplex und erfordert die Koordinierung der verschiedenen Verfahren, einschließlich Signalkaskaden und die Umlagerung von Zytoskelett-Komponenten. Die Zellen können nach dem Zufallsprinzip zu definierten chemischen Gradienten (Chemotaxis) bewegen (Chemokinese) sowie. Viele Techniken wurden entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu studieren. Die älteste und am weitesten verbreitete Technik, die Boyden-Kammer, bestehend aus einer vertikalen Zweikammersystem, in dem eine chemoattraktive Substanz in der unteren Kammer und die interessierenden Zellen angeordnet sind in der oberen Kammer 1 angeordnet. Die Bewegung der Zellen über die durchlässige Filter mit Poren definierter Größe zwischen den beiden Kammern wird überwacht. Zusätzliche Techniken entwickelt worden, um Zellmigration zu untersuchen, einschließlich der Zigmond Kammer 2 und der Kammer Dunn3. Diese kollektive Ansätze wichtige Einblicke in die Bewegung von vielen verschiedenen Zelltypen ergeben.
Zusätzlich zur Abfrage der Grundprinzipien der Chemokinese und Chemotaxis, haben Zweikammer-Tests für die Untersuchung von Zellmigration durch extrazelluläre Matrixkomponenten und sowohl endotheliale und epitheliale Zellschichten erleichtert. Ein Vorteil des Zweikammersysteme gegenüber anderen Techniken ist, dass die poröse Membran mit Proteinen wie Kollagen oder Fibrinogen beschichtet werden, und die Zellmigration in einem extrazellulären Matrix-ähnlichen Barriere kann beurteilt werden. Zusätzlich kann kultivierten Zelllinien gezüchtet und auf den durchlässigen Träger unterschieden werden. Um die Bewegung von Zellen in einer endothelialen Barriere zu untersuchen, werden kultivierte Endothelzellen ausgesät und in das obere Reservoir der durchlässigen Träger aufgewachsen. Bewegliche Zellen, wie Immunzellen, sind in den oberen Stausee und Migration in das untere Reservoir über die en hinzugefügtEndothel-Barriere in der physiologischen apikal-to-basolateralen Richtung beobachtet wird. Dieses Modell wurde im Verständnis Extravasation von Immunzellen aus dem Blutstrom von unschätzbarem Wert. Im Gegensatz zu transendotheliale Migration, die Bewegung von Zellen in einer epithelialen Barriere tritt typischerweise in der basolateralen-zu-apikal. Um diese Ereignisse in-vitro-Modell, Forschern und Samen wachsen kultivierten Epithelzellen an der Unterseite der durchlässigen Träger. Bewegliche Zellen werden in das obere Reservoir und Migration über die epitheliale Barriere, die die basolaterale-zu-apikal zugegeben wird überwacht. Solche Modelle der transepithelialen Migration haben wesentlich zu unserem Verständnis von Entzündungsreaktionen an Schleimhautoberflächen, insbesondere der Lunge und Darm 4,5 beigetragen.
Im Gegensatz dazu hat Immunzelltransport durch das Epithel der Harnwege viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Um unsere understandi weiter(; Neutrophilen PMN) Bewegung über eine Blase epithelialen Barriere 6 ng der angeborenen Immunantwort in den Harnwegen während der Infektion mit uropathogenen Escherichia coli (UPEC), einem in-vitro-Test, der die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Assay, die Untersuchung von polymorphkernigen Leukozyten ermöglicht entwickelten wir -8. Wie bei anderen Zweikammer-Modelle der transepithelialen Migration werden kultivierten humanen Epithelzellen der Blase an der Unterseite einer durchlässigen Träger gewachsen und bilden konfluente epitheliale Schichten. Menschliche Neutrophile aus venösem Blut isoliert werden zur basolateralen Seite der epithelialen Schicht aufgebracht, und die Migration in das Epithel im physiologisch relevanten basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine Infektion mit verschiedenen Stämmen von E. quantifiziert coli oder das Vorhandensein von chemoattraktiven Moleküle. Viel Forschung auf Neutrophilen Bewegung konzentriert hatte, sowohl Chemokinese und Chemotaxis, in Abwesenheit von zusätzlichen Zelltypen. Die transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test ist von Vorteil, da es berücksichtigt komplexen Wechselwirkungen zwischen Blase Epithelzellen und Immunzellen während der Infektion. Diese gefügig in vitro-Modell hat das Potenzial, um die detaillierte Untersuchung von Immunreaktionen bei uroepithelial Oberflächen zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit einem kultivierten Blasenzelllinie und frisch isolierten menschlichen PMN, haben wir ein in vitro Modell der transuroepithelial Migration von Neutrophilen. Dieses Modell wurde bei der Anfang, um die Komplexität der angeborenen Immunantwort während Harnwegsinfektion (HWI), eine extrem häufige bakterielle Infektion in der Regel durch UPEC 9 verursacht sezieren. Während der Infektion der Blase oder Zystitis ist Rekrutierung von PMN zu den Blasenlumen wichtig für bakterielle Clearance 10.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) unterstützt gewährt R01-DK080752 und P50-DK064540. Wir danken J. Loughman für ihre Bemühungen bei der Schaffung dieses Tests.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
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