التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان وعبر مثقف المثانة الظهارة
Summary
قمنا بتطوير نموذج في المختبر الذي يحاكي عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الالتهابية الحادة خلال العدوى من المثانة مع uropathogenic القولونية. وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة يتيح التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان عبر المثانة ظهائر، مثقف على دعامات قابلة للاختراق، واستجابة لعدوى بكتيرية أو مواد جاذب كيميائي.
Abstract
تجنيد الخلايا المناعية من المحيط إلى موقع الالتهاب هو خطوة ضرورية في الاستجابة المناعية الفطرية في أي سطح الغشاء المخاطي. خلال العدوى في المثانة البولية، والكريات البيض النوى (السوداء؛ العدلات) ترحيل من مجرى الدم واجتياز ظهارة المثانة. الفشل في حل العدوى في حالة عدم وجود استجابة عدلة يدل على أهمية PMN في الدفاع المثانة. لتسهيل استعمار ظهارة المثانة، uropathogenic القولونية (UPEC)، العامل المسبب لغالبية التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية)، يثبط الاستجابة الالتهابية الحادة باستخدام مجموعة متنوعة من الآليات المحددة جزئيا. لمزيد من التحقيق في التفاعل بين المضيف والممرض الجرثومي، وضعنا نموذجا في المختبر من هذا الجانب من الاستجابة المناعية الفطرية لUPEC. في مقايسة transuroepithelial الهجرة العدلة، والاختلاف على غرفة بويدن والمثانة مثقف epithتزرع الخلايا الليل إلى نقطة التقاء على الجانب السفلي من دعم منفذة. يتم عزل PMN من الدم الوريدي الإنسان ويتم تطبيقها على الجانب basolateral من طبقات الخلايا الظهارية المثانة. الهجرة PMN تمثل الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في استجابة لعدوى بكتيرية أو الجزيئات جاذب كيميائي يتم تعداد باستخدام عدادة الكريات. هذا النموذج يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين UPEC والخلايا حقيقية النواة وكذلك لاستجواب المتطلبات الجزيئية لاجتياز المثانة بواسطة ظهائر PMN. فإن نموذج الهجرة العدلة transuroepithelial تعزيز فهمنا للاستجابة التهابية الأولي لUPEC في المثانة.
Introduction
حركة الخلايا في جميع أنحاء الجسم، وغالبا عبر مسافات طويلة، ومطلوب من أجل النمو والتنمية، التئام الجروح، والاستجابة المناعية. الهجرة الخلية معقد ويتطلب تنسيق العديد من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك إشارة الشلالات وإعادة ترتيب مكونات هيكل الخلية. الخلايا يمكن ان تتحرك بشكل عشوائي (تنشيط كيميائي)، وكذلك نحو التدرجات الكيميائية المحددة (الكيميائي). وقد تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة الهجرة خلية في المختبر. توضع هذه التقنية الأقدم والأكثر شيوعا، وغرفة بويدن، يتكون من نظام من مجلسين الرأسي حيث يتم وضع مادة جاذب كيميائي في الغرفة السفلي وخلايا الفائدة في أعلى الغرفة 1. ويتم رصد حركة الخلايا عبر مرشح قابلة للاختراق، مع مسام حجم محددة، تفصل بين الغرفتين. وقد تم تطوير تقنيات إضافية لتحقيق الهجرة الخلية، بما في ذلك غرفة زيجموند 2 وغرفة دن3. وقد أسفرت هذه النهج الجماعي نظرة كبيرة في الحركة من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا.
بالإضافة إلى استجواب المبادئ الأساسية لتنشيط كيميائي والكيميائي، والمقايسات من مجلسين سهلت التحقيق الهجرة الخلية من خلال مكونات المصفوفة خارج الخلية وكل من طبقات الخلايا البطانية والظهارية. ميزة النظم من مجلسين أكثر من غيرها من التقنيات هو أن غشاء مسامي يمكن المغلفة مع البروتينات مثل الكولاجين أو الفيبرينوجين، والهجرة الخلية عبر الجدار مثل المصفوفة خارج الخلية يمكن تقييمها. بالإضافة إلى ذلك، خطوط خلايا مستنبتة يمكن زراعتها ومتباينة على دعامات قابلة للاختراق. للتحقيق في حركة الخلايا عبر حاجز غشائي، هي المصنفة الخلايا البطانية مثقف ونمت في الخزان العلوي من دعامات قابلة للاختراق. خلايا متحركة، مثل الخلايا المناعية، تضاف إلى الخزان العلوي والهجرة إلى الخزان السفلي عبر ENويلاحظ الحاجز dothelial في القمي، لbasolateral اتجاه الفسيولوجية. وكان هذا النموذج لا تقدر بثمن في فهم التسرب من الخلايا المناعية من مجرى الدم. وعلى النقيض من transendothelial الهجرة، وحركة الخلايا عبر حاجز الظهارية يحدث عادة في الاتجاه basolateral-إلى القمي. من أجل نمذجة هذه الأحداث في المختبر، والبذور الباحثين وتنمو الخلايا الظهارية مثقف على الجانب السفلي من دعامات قابلة للاختراق. تضاف خلايا متحركة إلى الخزان العلوي والهجرة عبر حاجز الظهارية، وتمثل الاتجاه basolateral-إلى القمي، يتم رصدها. وقد ساهمت هذه النماذج من الهجرة بطريق الظهارة بشكل كبير في فهمنا للالاستجابات الالتهابية في الأسطح المخاطية، وخاصة تلك التي في الرئة والأمعاء 4،5.
في المقابل، الاتجار الخلايا المناعية من خلال ظهارة المسالك البولية تلقت اهتماما أقل بكثير. لمزيد من understandi لدينانانوغرام من الاستجابات المناعية الفطرية في المسالك البولية خلال العدوى مع uropathogenic القولونية (UPEC)، ونحن وضعت في المختبر فحص، وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة، التي تمكن التحقيق من النوى الكريات البيض (السوداء؛ العدلة) التنقل عبر حاجز المثانة الظهارية 6 -8. كما هو الحال مع نماذج من مجلسين أخرى من الهجرة بطريق الظهارة، وتزرع الخلايا المستزرعة المثانة الإنسان الظهارية على الجانب السفلي من دعم نفاذية وتشكل طبقات متموجة الظهارية. العدلات الإنسان، معزولة عن الدم الوريدي، يتم تطبيقها على الجانب basolateral من الطبقة الظهارية، وكميا الهجرة عبر ظهارة في الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الاستجابة للعدوى مع سلالات مختلفة من E. كولاي أو وجود جزيئات جاذب كيميائي. وكانت أبحاث بكثير تركز على حركة العدلة، سواء تنشيط كيميائي والكيميائي، في ظل غياب أنواع الخلايا إضافية. وtransuroepithelial العدلة فحص الهجرة هو مفيد لأنه يأخذ بعين الاعتبار التفاعلات المعقدة بين الخلايا الظهارية المثانة والخلايا المناعية أثناء العدوى. هذا لين العريكة في المختبر نموذج لديه القدرة للسماح تحقيق مفصل من الاستجابات المناعية على السطوح uroepithelial.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام خط الخلية الظهارية المثانة مثقف والمعزولة حديثا PMN الإنسان، أنشأنا نموذجا في المختبر للهجرة العدلات transuroepithelial. وكان هذا النموذج فعال في بداية لتشريح تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية أثناء التهاب المسالك البولية (UTI)، وهو عدوى بكتيرية شائعة جدا تسبب …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01-P50-DK080752 وDK064540. نشكر J. Loughman لجهودها في إنشاء هذا الاختبار.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
