מותמרים החדרת טכנולוגיה מוקדמת לניטור התנהגות החרקים טיסה
Summary
We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.
Abstract
Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.
Introduction
החדרת אלקטרודות, אפילו עם מערכות אלקטרוניות המצורפות לחרקים ליישומי הקלטת telemetric, כבר שיטה גדולה כדי להבין איך תפקוד מערכות עצביות במהלך הטיסה טבעית 1. חיבור או השתלת מערכות מלאכותיות בחרקים הציבה אתגרים רבים מעורבים הפוטנציאל להפריע לטיסה הטבעית של החרקים. קובץ מצורף שטחי או החדרה כירורגית של פלטפורמות מלאכותיות על החרק הבוגר אינו מהימן בשל הסטה אפשרית של המכשירים הוכנסו שנגרמו על ידי כוחות אינרציה והלחץ-Induced גוף. באופן שטחי מצורף או אלקטרודות מוכנסות בניתוח הן גם נוטים להידחות על ידי החרקים כגוף זר. יתר על כן, ניתוח ההשתלה דורש את הסרת קשקשים וערימות סביב השלד החיצוני. שכבת הקוטיקולה העבה גם צריכה להיות חדרה לעצבוב כירורגית אשר יכול לגרום נזק לרקמות בטחונות, ובכך מפריעה לטיסה הטבעית של החרקים. כל tגורמי hese יכולים לעשות פעולת השתלה כירורגית או שטחית משימה מאתגרת ועדינה. על מנת להקל על החששות אלה מעורבים באופן חיצוני חיבור מערכות בקרה וחישה לחרקים, המתודולוגיה רומן מעורבת צמיחה מותמרים שיתואר במאמר זה.
הפיתוח מותמרים של חרקים holometabolic מתחיל עם הפיכתו של הזחל (או נימפה) למבוגרים עם שלב גלמי ביניים (איור 1). תהליך המטמורפוזה כולל תכנות מחדש של רקמות נרחבות הכוללים התנוונות ואחרי שיפוץ. השינוי הזה הופך זחל יבשתי למבוגרי חרקים מפגינים כמה התנהגויות מורכבות 2,3.
ההישרדות של חרקים לאחר ניתוחי parabiotic קיצוניים הודגמה בי הניתוחים בוצעו בשלבים המוקדמים מותמרים 4,5. בניתוחים אלה, קאוס histogenesis התפתחותייםפצעי ניתוח ed לתיקון במשכי זמן קצרים יותר. בעקבות תצפיות אלה, טכניקה חדשה פותחה בי השתלת אלקטרודות מוליך חשמלי בוצעה בשלבים המוקדמים יותר של צמיחה מותמרים (איור 1). זה מאפשר מצורף biomechanically מאובטח על החרקים 6. ממשק מאוד אמין גם מאובטח עם העצבי של החרק ומערכות התוקפת 7. טכניקה זו ידועה בשם "בתחילת גלגול החדרת הטכנולוגיה" (לפלוט) 8.
לאחר הבנייה מחדש של מערכת הרקמה כולה, מבנים הוכנסו לגולם לצאת עם החרק הבוגר. קבוצות שרירים טיסה להפוך עד 65% מכלל מסת גוף ובית החזה, ובכך, מהווה מטרה נוחה יחסית להליך לפלוט 9. במהלך פעימת האגף הבסיסי, השינויים במורפולוגיה של הטיסה הפעלת dorsolongitudinal (ד"ל) וdorsoventral (DV) שרירים לגרום articulat הכנףגיאומטריה יון לייצר עילוי 10. לכן התיאום התפקודי של שרירי ד"ל וDV כבר נושא למחקר פעיל בנוירופיזיולוגיה טיסה. חרקים קשירה בסביבה חזותית אלקטרוני מתוכנת היו השיטה הנפוצה ביותר ללימוד נוירופיזיולוגיה של התנהגויות מורכבות locomotory 11,12. זירות גליליות מורכבות מפנלי דיודה פולטות אור כבר משמשות עבור סביבות מציאות מדומה אלה, שבו חרקים מעופפים הם קשורים באמצע והתנועה היא מדומה על ידי דינמי מעדכן את התצוגה ויזואלית פנורמי שמסביב. במקרה של חרקים קטנים יותר, כגון זבוב פירות דרוזופילה, קשירה מושגת על ידי הצמדת סיכת מתכת לבית החזה הגבי של החרק ולמקם את הסיכה מתחת למגנט קבוע 13,14. שיטה זו מאפשרת רק כימות של תגובות מוטוריות באמצעות תצפיות חזותיות עם מצלמות במהירות גבוהה ללא כל ניתוח אלקטרו. יתר על כן, ספיד זהOD כבר לא יעיל להשעות את הגוף הגדול יותר וכבד יותר של סקסטה Manduca. כדי לפתור בעיה זו, אנו נהנינו ממסגרות מגנטי מרחף שבו משקל קל מסגרות עם המגנטים מצורפים לתחתית שלהם לרחף באמצעות כוחות אלקטרומגנטיים. בשילוב עם מגברים עצביים זמינים מסחרי ומערכי LED, זה מספק פלטפורמה לבקרת פלט הטיסה מנוע ולהקליט אלקטרופיזיולוגיה הקשורה של סקסטה Manduca.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים במהלך ההחדרה כירורגית של אלקטרודות ההקלטה המשפיעות על היכולת להקליט נתונים בשלבים מאוחר יותר של הפרוטוקול. אלקטרודות ההקלטה צריכה להיות מוכנסות לתוך יום הגולם אחד אחרי מציג כתמי כנף בצד הגב שלה. אם ההכנסה מבוצעת שניים או יותר ימים אחרי כל הזמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
א.ב. מודה בתודה הקרן הלאומית למדע למימון במסגרת תכנית הסייבר פיזי מערכות (1239243) ואגף לחינוך לתואר ראשון (1245680); והמחקר מתקדם פרויקט סוכנות ההגנה (DARPA) לתמיכה בשלבים המוקדמים של עבודה זו. השלבים המוקדמים של עבודה זו בוצעו על ידי א.ב. במעבדתו של פרופ 'עמית לאל באוניברסיטת קורנל. הודות AB Ayesa Sinha ופרופ 'לאל להדרכה ניסיונית ודור רעיון בשלב זה. Manduca סקסטה (לינאוס 1763) התקבלו ממושבה ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת דיוק, דורהם, צפון קרוליינה, ארה"ב. עש שימש בתוך 5 ימים של eclosion. ברצוננו להודות למשולש Biosystems בינלאומי, במיוחד דוד Juranas וקייטי Millay על סיועם מצוין טכני ושימוש במערכת Neuroware. כמו כן, אנו רוצים להודות וויל קאפי על עזרתו במהלך ניסויים.
Materials
| Coated stainless steel wire | A-M Systems | 791900 | 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed |
| Flexible electrode wire | Litz or inductor wire can be used. | ||
| Surface-mount FFC connector | Hirose Connector | FH28E-20S-0.5SH(05) | |
| Tweezers | Grobet USA | N/A | Clean with 70% alcohol before use on the insect. |
| Kim-Wipes | Kimberly-Clark Worldwide | 34155 | Any size delicate-wipe tissues can be used. |
| Teflon tape | N/A | N/A | 5 mm width Teflon tape. |
| Hypodermic Needle | Becton Dickinson & Co. | 30511 | 20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge. |
| Rigid Fixation Stick | N/A | N/A | Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers) |
| Insect Emergence Cage | N/A | N/A | Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed. |
| Thermal Cauterizer | Advanced Meditech International | CH-HI CT2103 (tip) | Optional equipment used for application of dental wax. |
| Dental Wax | Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma | N/A | Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect. |
| Magnetic Levitation Platform | N/A | N/A | Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping |
| CA40 Instant Adhesive | 3M | 62-3803-0330-5 | Avoid skin contact. Use gloves when handling. |
| 70% Isopropyl alcohol | store brand | Commercially available from many suppliers. | |
| PCB Etchant | RadioShack | 276-1535 | Toxic if swallowed or ingested, skin irritant |
| EQUIPMENT: | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| TBSI Neuroware Software | Triangle Biosystems International | N/A | NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html |
| TBSI Wireless Recording System | Triangle Biosystems International | W5 FI | USB Base station, headstage unit, charger |
| 16 Channel Amplifier A-C Amplifier | A-M Systems | 950000 | Model 3500 (110 V) |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DSO1014A | Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel |
| Microscope | N/A | N/A | 5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction. |
| Ultrasonic Cleaner | ColeParmer | EW-08848-10 | Ultrasonic Cleaner with Timer, |
References
- Taubes, G. Biologists and engineers create a new generation of robotics that imitate life. Science. 288 (7), 80-83 (2000).
- Duch, C., Bayline, R. J., Levine, R. B. Postembryonic development of the dorsal longitudinal flight muscle and its innervation in Manduca sexta. Journal of Comparative Neurology. 422 (1), 1-17 (2000).
- Levine, R. B., Morton, D. B., Restifo, L. L. Remodeling of the insect nervous system. Current opinion in neurobiology. 5 (1), 28-35 (1995).
- Williams, C. M. Physiology of insect diapause: the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm Platysamia cecropia. Bio. Bull. 90, 234-243 (1946).
- Williams, C. M. The juvenile hormone. II. Its role in the endocrine control of molting, pupation, and adult development in the Cecropia silkworm. Bio. Bull. 121, 572-585 (1961).
- Bozkurt, A., Lal, A., Gilmour, R. Radio control of insects for biobotic domestication. 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering. , 215-218 (2009).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. In vivo electrochemical characterization of a tissue–electrode interface during metamorphic growth. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (8), 2401-2406 (2011).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Insect–machine interface based neurocybernetics. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1727-1733 (2009).
- Chapman, R. F. . The Insects: Structure and Function. , (1998).
- Eaton, J. L. Morphology of the head and thorax of the adult tobacco hornworm, Manduca sexta (Lepidoptera:Sphingidae). I. Skeleton and muscles. Annals of the Entomological Society of America. 64, 437-445 (1971).
- Resier, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 127-139 (2008).
- Dombeck, D. A., Reiser, M. B. Real neuroscience in virtual worlds. Current opinion in neurobiology. 22 (1), 3-10 (2011).
- Weir, P. T., Dickinson, M. H. Flying drosophila orient to sky polarization. Current Biology. 22 (1), 21-27 (2012).
- Ristroph, L., Bergou, A. J., et al. Discovering the flight autostabilizer of fruit flies by inducing aerial stumbles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4820-4824 (2010).
- Strauss, R., Schuster, S., Götz, K. G. Processing of artificial visual feedback in the walking fruit fly Drosophila melanogaster. The Journal of experimental biology. 20 (9), 1281-1296 (1997).
- Lindemann, J., Kern, R., Michaelis, C., Meyer, P., van Hateren, J., Egelhaaf, M. FliMax, a novel stimulus device for panoramic and highspeed presentation of behaviourally generated optic flow. Vision Research. 43 (7), 779-791 (2003).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of neuroscience methods. 167 (2), 127-139 (2008).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Balloon-assisted flight of radio-controlled insect biobots. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (9), 2304-2307 (2009).
