Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving
Summary
Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.
Abstract
In de afgelopen jaren, heeft twee-foton beeldvorming uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de neurowetenschappen, omdat het zorgt voor chronische meting van de activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag 1-6. Hier beschrijven we methoden naar twee-foton beeldvorming uitvoeren muis cortex terwijl het dier navigeert een virtual reality omgeving. We richten ons op de aspecten van de experimentele procedures die essentieel zijn voor de beeldvorming in een gedragen dier in een helder verlichte virtuele omgeving zijn. De belangrijkste problemen die zich voordoen in deze experimentele opstelling die we hier adresgegevens zijn: het minimaliseren van de hersenen motion gerelateerde artefacten, het minimaliseren van licht lekken van de virtual reality projectiesysteem, en het minimaliseren van laser-induced weefselschade. We bieden ook sample software om de virtual reality omgeving controleren en leerling bijhouden doen. Met deze procedures en middelen moet het mogelijk zijn om een conventionele twee-foton microscoop voor gedragen te converteren in muizen.
Introduction
Twee-foton beeldvorming van calcium indicatoren (genetisch gecodeerd zoals GCaMP5 7 of R-GECO 8, of synthetische kleurstoffen zoals OGB of Fluo4) heeft zich ontpopt als een krachtige methode voor het meten van neuronale activiteit in gedragen muizen 1-6. Het maakt de gelijktijdige meting van de activiteit van honderden cellen bij bijna enkele actiepotentiaal resolutie tot ongeveer 800 urn onder het hersenoppervlak 9,10. Bovendien, met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIS) neuronale activiteit kan worden gemeten chronisch 5,11,12, en genetische gedefinieerde celtypes 13. Samen bieden deze methodes een zekere mate van temporele en ruimtelijke resolutie die het openen van een veelheid aan nieuwe mogelijkheden in de studie van neuronale berekening in vivo.
Chirurgische ingreep noodzakelijk is om bloot te leggen en het etiket van de hersenen van muizen voor de beeldvorming. Cellen worden kenmerkend getransfecteerd met een recombinant adeno geassocieerde vir us (AAV) voor GECI levering en een craniale venster wordt ingeplant op de injectieplaats om optische toegang tot de hersenen te krijgen. Een hoofd balk wordt dan aan de schedel voor kop bevestiging kader van de twee-foton microscoop bevestigd. Het ontwerp en de uitvoering van deze stappen is van cruciaal belang, aangezien de meeste van de problemen met wakker beeldvorming ontstaan van instabiliteiten in de voorbereiding. Idealiter zou de hier beschreven procedure mogelijk maken chronische beeldvorming tot enkele maanden na de operatie.
Om visueel geleide gedrag tijdens twee-foton beeldvorming mogelijk te maken, de kop vaste muis zit op een lucht ondersteund sferische loopband, die zij kan gebruiken om een virtual reality omgeving te navigeren. Locomotion van de muis op de loopband is gekoppeld aan beweging in de virtuele omgeving die wordt weergegeven op een ringkern scherm rond de muis 14,15. Behavioral variabelen zoals motoriek, visuele stimulus, en leerling positie kan worden opgenomen 6.
t "> We beschrijven de bij chronische twee-foton beeldvorming in muizen verkennen van een virtual reality omgeving procedures De belangrijkste punten behandeld:. reductie van bewegingsartefacten, vermindering van licht lekken, maximalisatie van het aantal gelijktijdig opgenomen cellen en minimalisering van foto schade. We bieden ook informatie over het instellen van de lucht ondersteund loopband, pupil tracking, en de virtual reality omgeving. De hier beschreven procedures kan worden gebruikt voor het afbeelden van fluorescent gelabelde celpopulaties in het hoofd vast muizen in een potentieel breed scala van gedrags-paradigma .Protocol
Representative Results
Discussion
De sleutel tot het succes van gedrags twee-foton beeldvorming is de stabiliteit van het preparaat op twee manieren:
- In de loop van de dagen na de implantatie venster, kan ontstekingsreacties van het weefsel leiden tot verbetering van de vorming van granulatieweefsel en kraakbeen dat zal belemmeren of zelfs beeldvorming te voorkomen.
- Tijdens het experiment de hersenen stabiel genoeg om te voorkomen bewegingsartefacten van beschadiging neurale activiteit met betrekking fluorescentiesignaal is. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, het Max Planck Society, en het Human Frontier Science Program.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
