ثنائي الفوتون التصوير الكالسيوم في الفئران التنقل إلى هذا الشخص واقع البيئة
Summary
نحن هنا وصف الإجراءات التجريبية المشاركة في التصوير ثنائي الفوتون من الماوس القشرة خلال السلوك في بيئة الواقع الافتراضي.
Abstract
في السنوات الأخيرة، أصبح التصوير ثنائي الفوتون أداة لا تقدر بثمن في علم الأعصاب، كما أنه يسمح لقياس مزمن في نشاط الخلايا التي تم تحديدها وراثيا خلال السلوك 1-6. نحن هنا وصف الطرق لأداء اثنين من الفوتون التصوير في الماوس القشرة بينما يتنقل الحيوان بيئة الواقع الافتراضي. ونحن نركز على جوانب الإجراءات التجريبية التي هي مفتاح التصوير في حيوان يتصرف في بيئة افتراضية المضاءة. المشاكل الرئيسية التي تنشأ في هذا الإعداد التجريبية أننا هنا عنوان هي: التقليل من الحركة المتعلقة التحف الدماغ، والتقليل من تسرب الضوء من نظام الإسقاط الواقع الافتراضي، والتقليل من الليزر التي يسببها تلف الأنسجة. كما نقوم بتوفير البرمجيات عينة للسيطرة على البيئة والواقع الافتراضي للقيام تتبع التلميذ. مع هذه الإجراءات والموارد يجب أن يكون من الممكن تحويل التقليدية المجهر ثنائي الفوتون لاستخدامها في التصرف الفئران.
Introduction
برز التصوير ثنائي الفوتون من مؤشرات الكالسيوم (المشفرة وراثيا مثل GCaMP5 7 أو R-8 جيكو، أو الأصباغ الاصطناعية مثل OGB أو Fluo4) كوسيلة من وسائل قوية لقياس نشاط الخلايا العصبية في الفئران يتصرف 1-6. فإنه يمكن قياس وقت واحد لنشاط مئات الخلايا في عمل واحد بالقرب من القرار المحتملة، وتصل إلى ما يقرب من 800 ميكرومتر تحت سطح الدماغ 9،10. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIS) نشاط الخلايا العصبية ويمكن قياس مزمنة 5،11،12، وأنواع الخلايا المحددة وراثيا 13. معا، وهذه الأساليب توفير درجة من الدقة الزمنية والمكانية التي تفتح العديد من الإمكانيات الجديدة في دراسة حساب الخلايا العصبية في الجسم الحي.
التدخل الجراحي ضروري لفضح وتسمية مخ الفأر للتصوير. عادة و transfected الخلايا باستخدام المؤتلف الغدة المرتبطة فير هو مزروع لنا (AAV) نظام للتسليم جيتشي ونافذة في الجمجمة خلال موقع الحقن للوصول البصرية إلى الدماغ. ثم يتم إرفاق شريط الرأس في الجمجمة لتثبيت الرأس تحت المجهر ثنائي الفوتون. تصميم وتنفيذ هذه الخطوات أمر بالغ الأهمية لأن معظم المشاكل مع التصوير مستيقظا تنشأ من عدم الاستقرار في التحضير. مثالي الإجراء الموضح هنا يجب أن تسمح للتصوير المزمن تصل إلى عدة أشهر بعد الجراحة.
لتمكين السلوك الموجهة بصريا أثناء التصوير ثنائي الفوتون، رئيس الماوس ثابتة يجلس على حلقة مفرغة الهواء يؤيد كروية، والتي يمكن استخدامها للتنقل بيئة الواقع الافتراضي. ويقترن تحرك الماوس في حلقة مفرغة للحركة في البيئة الظاهرية التي يتم عرضها على شاشة حلقية المحيطة 14،15 الماوس. المتغيرات السلوكية مثل الحركة والتحفيز البصري، وموقف التلميذ يمكن تسجيل 6.
ر "> ونحن تصف الإجراءات اللازمة في التصوير المزمنة ثنائي الفوتون في الفئران استكشاف بيئة الواقع الافتراضي النقاط الرئيسية التي تناولها هي: الحد من حركة القطع الأثرية، والحد من تسرب الضوء، تعظيم عدد الخلايا سجلت في وقت واحد، والتقليل من الضرر الصورة، ونحن أيضا تقديم تفاصيل حول إعداد حلقة مفرغة المدعومة من الهواء، وتتبع التلميذ، والبيئة الواقع الافتراضي. الإجراءات الموضحة هنا يمكن أن تستخدم لتصوير السكان الخلية fluorescently المسمى في الرأس الفئران ثابتة في مجموعة متنوعة واسعة من النماذج يحتمل السلوكية .Protocol
Representative Results
Discussion
المفتاح لنجاح السلوكية التصوير ثنائي الفوتون هو استقرار إعداد بطريقتين:
- على مدى أيام آخر نافذة الزرع، يمكن أن الاستجابات الالتهابية في الأنسجة يؤدي إلى تعزيز تشكيل النسيج الحبيبي والغضاريف التي من شأنها أن تعرقل أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل معهد فريدريش ميشر للبحوث الطبية الحيوية، وجمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم حدود الإنسان.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
