Met behulp van flatbed scanners om High-resolution-Time vervallen Beelden van de Arabidopsis wortel gravitropic Response Collect
Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor snelle verzameling afbeeldingen van Arabidopsis zaailingen reageren op een stimulus zwaartekracht met behulp van commercieel verkrijgbare flatbed scanners. De methode maakt het mogelijk voor goedkope, high-volume vastleggen van beelden met hoge resolutie vatbaar voor downstream analyse algoritmen.
Abstract
Onderzoek in de biologie steeds meer behoefte aan het gebruik van methodologieën die high-volume collectie van hoge-resolutie data mogelijk te maken. Een uitdaging laboratoria kan worden geconfronteerd is de ontwikkeling en verwezenlijking van deze methoden. Observatie van fenotypes in een proces van belang is een typische doelstelling van onderzoekslaboratoria bestuderen van gen-functie en dit wordt vaak bereikt door middel van het vastleggen van beelden. Een bijzonder proces dat vatbaar is voor observatie met behulp van beeldvormingstechnieken is de corrigerende groei van een zaailing wortel die is verplaatst van de aanpassing aan de zwaartekracht vector. Imaging platformen aan de wortel gravitropic respons te bepalen kan duur, relatief lage doorzet en / of arbeidsintensief. Deze kwesties zijn aangepakt door de ontwikkeling van een high-throughput image capture methode met behulp van goedkope, maar kwalitatief resolutie flatbed scanners. Met behulp van deze methode, kunnen de beelden worden vastgelegd om de paar minuten op 4800 dpi. De huidige opstelling maakt verzameling van 216 individuele rNTWOORDEN per dag. Het beeld verzamelde gegevens is van voldoende kwaliteit voor beeldanalyse toepassingen.
Introduction
Collectie van hoge-resolutie fenotypische gegevens nuttig zijn in studies die gericht zijn op het samenspel van genen en omgeving te begrijpen in het bemiddelen organismal functie 1,2. Studies van deze aard zijn ook inherent grote omvang, waardoor het bovendien noodzakelijk dat methoden voor het meten fenotypen in dit verband een hoog debiet 3,4. De vaststelling van methoden phenomics grootschalig onderzoek, afwegingen tussen doorvoer en resolutie in het spel komen. Methoden die hoger zijn overslag ook de neiging lager te zijn in de resolutie, waardoor het moeilijker om kleine effecten van genetica of omgeving 5 detecteren. Als alternatief, methoden die een gewenste fenotype meer zorgvuldig meet ook de neiging lager te zijn van de overslag, waardoor het moeilijk is om genetische en milieu-effecten in grote lijnen overzien. Bovendien kan handmatige methoden voor het kwantificeren fenotypes, zoals visuele inspectie worden gewijzigd op door verschillen in menselijke perperceptie 6.
Imaging technologieën kan een nuttige brug tussen doorvoer en resolutie voor het verkrijgen van fenotypische waarnemingen 7-9. In het algemeen, een beeld is relatief eenvoudig te vangen vergemakkelijken doorvoer, en wanneer genomen in voldoende resolutie, subtiele fenotypes gedetecteerd 1,2,7. Imaging technologieën hebben de neiging aanpasbaar aan een systeem of proces van belang om fit te zijn en zijn over het algemeen schaalbaar 10-12. Hierdoor beeldvormende technieken zijn ideaal voor de ontwikkeling van grootschalige studies organismale functie.
De reactie van de primaire wortel naar een zwaartekracht prikkel is een ingewikkeld fysiologisch proces dat plaatsvindt binnen een morfologisch eenvoudige orgel. De reactie omvat activatie van signaaltransductiewegen die zich voortplanten door de wortel orgaan en de progressie bepaald wordt door omgevingsfactoren en genetische factoren, waaronder genetische factoren beïnvloed door de omgeving 12-14 </sup>. De reactie van de primaire wortel naar een zwaartekracht prikkel is minstens bestudeerd sinds Darwin, maar er is veel te leren over hoe het werkt, vooral in de vroege signalering evenementen en in de factoren betrokken reactie plasticiteit 12,14,15. Het verkrijgen van een gedetailleerd begrip van de dynamiek van deze reactie is belangrijk vinden van manieren om het vermogen van zaailingen met succes worden binnen een bepaalde omgeving 16 vastgesteld verbeteren. Bovendien is de vorm van de wortels is het vatbaar voor beeldbewerkingstoepassingen 8,12,17. Samen genomen, de wortel gravitropic respons is een ideaal systeem voor de ontwikkeling van high-throughput imaging technologie voor het verrichten van genomics-niveau studies van organismal functie.
In dit rapport wordt een high-throughput, hoge-resolutie methode voor het vastleggen van de wortel gravitropic respons met behulp van goedkope, commercieel verkrijgbare flatbed scanners gepresenteerd. Het overzicht van deprotocol wordt getoond in figuur 1. Zaailingen geplant op agar platen werden geplaatst op verticaal georiënteerde flatbed scanners uitgerust met op maat plexiglas plaat houders. Beelden werden om de paar minuten op 4800 dpi verzameld en opgeslagen op een lokale schijf of dataserver. Metadata gekoppeld aan elke afbeelding serie wordt opgeslagen in een database en de opgeslagen beelden worden verwerkt. De aanpak maakt gebruik van de VueScan software voor het vastleggen van beelden. VueScan kan worden gebruikt om meer dan 2100 verschillende scanners op Windows, Mac of Linux besturingssystemen draaien (zie ook Materiaal tabel). Een scanresolutie van 4800 dpi werd gebruikt in deze toepassing om de resolutie bereikt in eerdere studies met behulp van vaste CCD-camera's 1,8,12 passen. De flexibiliteit van de VueScan software samen met de gemeenschappelijke interface die hij voor elke scanner loopt stelt gebruikers in staat om gemakkelijk vast te stellen vrijwel elke scanner hardware van voldoende resolutie om het protocol in dit document. Huidige doorvoer zorgt voor het verzamelen van216 individuele antwoorden per dag. De technologie is aanpasbaar en schaalbaar voor gebruik bij instellingen, variërend van hoge scholen tot universiteiten onderzoek. Bovendien zijn de verzamelde beelden zijn van voldoende kwaliteit voor beeldanalyse toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige fenotypische waarneming is cruciaal voor het begrijpen van de manifestaties van genfunctie in een organisme. Een manier om fenotypische informatie te verkrijgen is door het vastleggen van de beeldgegevens met een hoge resolutie. De-scanner gebaseerd platform ontwikkeld heeft verzameling van vele beelden (200 beelden / scan periode) ingeschakeld bij een hoge resolutie (4800 dpi) gedurende een aantal uren. Bovendien is dit platform gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van laboratorium en klaslokaalmilieu vanwege de flexibiliteit van de VueScan software om duizenden verschillende scanners via een gemeenschappelijke interface 18 draaien.
De hier gepresenteerde methode vult een leegte in high-throughput beeldregistratie dat zich uitstrekt van grootschalige fenotypering installaties en geautomatiseerde systemen implementeerbaar in een laboratorium. De high-throughput platformen die momenteel beschikbaar zijn hebben de neiging om gespecialiseerde beeldvormende apparatuur, waaronder camera's gemonteerd op robot ondersteunt, om hoge-resolutie afbeeldingen van p vastleggenrimarily bovengronds plantenweefsel (bv. Centre for Integrative Plant Technology en de Scanalyzer HTS door LemnaTec) 20,21. Gespecialiseerde beeldvormende systemen met behulp van röntgen-en MRI-technieken zijn ook ontwikkeld om de afbeelding onder de grond weefsels met opmerkelijke resolutie als ze groeien in de bodem omgeving (bijv. Centre for Integrative Plant Technology) 11,22,23. De ontwikkeling van gespecialiseerde technieken algemeen ten koste van doorvoer, waardoor dynamische fenotypische studies bemoeilijkt. Belangrijk is dat de kosten en de behoefte aan infrastructuur voor deze high-end platforms maken ze meestal niet haalbaar voor implementatie in kleinere laboratoria.
Platforms zijn ook ontwikkeld die meer standaard image capture technologie en zijn goed geschikt voor het meten van dynamische reacties zoals de wortel reactie op een zwaartekracht stimulus. Bijvoorbeeld, zijn CCD-camera gebruikt om individuele zaailing antwoorden vangen licht en dichtheid bij hogeruimtelijke en temporele resolutie 1,8,12. Andere systemen zijn ontwikkeld waardoor de meting van de wortel tip oriëntatie van meerdere wortels uit een enkel beeld (bijvoorbeeld RootTipMulti door de iPlant Collaborative) 17,24. In het eerste geval wordt throughput relatief laag aangezien slechts een zaailing wordt afgebeeld door elke camera tegelijk, terwijl in het laatste geval debiet hoger, maar gewoonlijk ten koste van resolutie.
De procedure die in dit document stelt een platform voor het vastleggen van hoge-resolutie afbeeldingen in high throughput met apparatuur en software die direct beschikbaar en relatief betaalbaar zijn. Met behulp van deze opstelling, kan 1.080 individuele wortel reacties worden verzameld elke week in een laboratorium uitgerust met een bank van zes scanners. In 15 maanden verzamelen gemiddeld 864 individuele reacties per week, in totaal 41.625 zaailingen werden gescand voor genomics onderzoek. Ongeveer 15% van de individuele collecties mislukte vanwege een verkeerde instelling fout, netwrk storing of defect aan de apparatuur. Een andere respons van 22% niet te wijten aan gebrek aan kieming of onvoldoende wortelgroei een groei reactie uit te lokken. De uiteindelijke dataset bestaat uit 27.475 individuele zaailing antwoorden op een zwaartekracht stimulans van 163 recombinante inteeltlijnen plus 99 in de buurt van isogene lijnen. De gegevens werden verzameld in een laboratorium, waardoor dit een zeer high-throughput aanpak. Ook gezien het feit dat de voor overname apparatuur is relatief goedkoop, het is betrouwbaar gefunctioneerd meer dan twee jaar zelfs met zwaar gebruik.
Hoewel dit protocol zeer nuttig voor het onderzoek doelstellingen van deze groep is geweest, een aantal beperkingen bestaan nog steeds. Door het debiet van ongeveer 50 GB ongecomprimeerde beeldgegevens per dag, bleek dat een grote hoeveelheid ruimte nodig was om huis beelden tenzij effectieve compressie schema kunnen worden ontwikkeld. De opslag probleem werd tijdelijk opgelost door de aankoop van externe harde schijven voor elke computer. Bovendien, twee 10 TB netwerk verbonden opslag-apparaten werden aangeschaft. Later werden compressie algoritmen ontwikkeld, zoals hierboven beschreven, die kunnen helpen om de gegevensgrootte met maximaal 60% (figuur 8). Het is belangrijk op te merken dat de snelheid waarmee gegevens kunnen worden opgeslagen op een netwerk verbonden opslag apparaat is afhankelijk van de snelheid van de netwerkverbinding. Compressie schema zijn ook beperkt als gevolg van de wens om het verlies van beeldgegevens te voorkomen.
Andere beperkingen die specifiek zijn voor een-scanner gebaseerd imaging systeem worden ook overwogen. Bijvoorbeeld, in een scanner aanpak zaailingen worden blootgesteld aan licht van hoge intensiteit in het witte en mogelijk infrarode bereik tijdens elke scan. Dit beïnvloedt waarschijnlijk zaailingsgroei, maar zaailingen nog waarneembaar robuuste reacties ondergaan om een zwaartekracht stimulus (figuur 7). Een toekomstige verbetering zou inhouden programmering scanners zoals dat alleen infrarood LED's actief zijn. Een gebied in actieve development is creatie van algoritmes goed afgestemd op de resolutie en doorvoer van deze beeldgegevens. De grote dataset gegenereerd met behulp van deze-scanner gebaseerde methode is ideaal voor de ontwikkeling van robuuste gereedschappen voor high-throughput fenotypering van zaailing beelden geweest. De compressie-algoritme toegepast op de afbeeldingen weergegeven in figuur 7 ondersteunt de bewering dat ze vatbaar zijn voor beeldanalyse toepassingen. Bovendien kan de gegenereerde beelden worden geanalyseerd door de eerder gepubliceerde algoritme RootTrace 17,24, als ze verzameld op lagere resolutie (minder dan 1.200 dpi), en individuele zaailingen zijn gesegmenteerd uit het beeld met het compressiealgoritme hierboven beschreven voor de analyse. Wortelgroei gegevens kunnen worden geëxtraheerd uit beelden gereduceerd tot 1200 dpi, terwijl tip hoek van gegevens van afbeeldingen teruggebracht tot 900 dpi (niet gepubliceerde waarneming) kan worden gewonnen.
De procedure die in dit document past in zijn eigen niche in de wereld van de root beeldvorming doordat het hoge doorvoer en hoge resolutie en toch relatief betaalbaar. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan de beeldvorming behoeften van een bepaalde onderzoeksgroep tegemoet.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Science Foundation (award aantal IOS-1031416) en is uitgevoerd in samenwerking met Nathan Miller, Logan Johnson en Edgar Spalding van de Universiteit van Wisconsin en Brian Bockelman, Carl Lundstedt en David Swanson van de Universiteit van Nebraska Holland Computing Center.
Materials
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
| Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
| Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. Genetics. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. . Root Development. , 157-174 .
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
