背景和线索恐惧制约试验小鼠中使用视频分析系统

所有的实验中，应根据当地动物护理和使用委员会制定的指导和协议来执行。 1。设备设置用于调节和上下文试验装置是一个方腔室与electrifiable格栅地板，声源，和一个校准震动发生器。各种房型大小时，从54厘米尺寸不同×27厘米×30厘米21到25公分X 35公分x30厘米22。在此协议中，该装置包括一个丙烯酸类正方形室（33厘米×25厘米×28厘米;透明的前壁和后壁;白在侧壁）与金属网格（0.2cm直径的，间隔开的0.5厘米分开）覆盖通过透明的丙烯酸盖（ 图1A）。有必要将室内的白色亚克力层（ 图1B）来分析黑，刺鼠，或稀棕色小鼠的行为，因为图像分析系统与ImageFZ软件程序（可免费下载，见表材料/试剂）区别于白色背景中的每个捕获的视频图像较暗的对象。白化小鼠也可以使用黑色的金属网格和黑色亚克力层（ 图1B）进行测试。发光二极管（LED）灯被安装在装置上方的天花板上。网格地板是由LED灯点亮，在100勒克司。连接到一个白噪声/音调发生器（ 图1C）扬声器安装在天花板上5厘米上面的盖子呈现听觉提示（白噪声55 DB）作为条件刺激（CS）。该网格连接到一个震动发生器（ 图1C），可提供电动电击作为非条件刺激（美国）。试验室被放置在一个隔音房间（170厘米×210厘米×200厘米）（ 图1D）在测试期间尽量减少外部噪声。这个条件也防止了没有被经受的小鼠从听觉的听觉线索或测试小鼠的发声测试。 对于提示的测试装置被构成的，即具有从调节室不同的性质的腔室，提供了新的上下文。当务之急是要改变感官线索尽可能使鼠标感知新颖的历境作为是无关的调节室。一般地，一个不同形状的方块或三角形腔室被使用。此外，不同的照明和/或嗅觉也提供到鼠标。在这个协议中，该装置是一种丙烯酸三角形腔室（33厘米×29厘米×32厘米;白在每个侧壁）与平坦，白色的地板为黑色，刺豚鼠，或稀棕色小鼠或平坦，黑色地板白化小鼠，覆盖着透明的压克力盖子（ 图1E）。 LED灯安装在装置上方的天花板上。地板的照度水平被设定为30勒克司。一位发言者是安装在天花板上5厘米上面的盖子公关ESENT听觉提示说是一样的，在空调的时间提供给小鼠。三角室坐落在一个不同的隔音室从其中空调和上下文测试执行了房间。 每个腔室都配备了安装在天花板上电荷耦合器件（CCD）摄像机通过四通道视频分配器和USB影像撷取装置来监视鼠标的行为，以及设备和鼠标的图像连接到Windows电脑被捕获和分析的应用软件程序ImageFZ（见协议6）。白噪声和电击发生器是由ImageFZ软件程序自动控制，开始时间和白噪声和电击的持续时间必须被写入到一个文本文件（见的视频显示一个示例文本文件'简单COND“关于如何将参数写入到文件中的信息），该被读入的应用程序。 在每次测试开始时，丙烯酸墙壁和地板擦拭浸泡在超级次氯酸水（pH 6-7）毛巾，以及网格用70％乙醇清洗，以防止基于嗅觉的偏压。的网格，用乙醇擦拭，而不是超次氯酸水，以确保该网格并不减少其电导率由于生锈。 2。动物的制备一般来说，两到四个小鼠在温度控制持房（23±2℃）与12小时亮/暗周期（ 如在早上7:00开灯）住每笼。 在这个协议中，以减少运输笼的可能影响对行为和对小鼠适应实验环境，包含小鼠的笼从该动物保持室转移到相邻的一个隔音测试室，至少30分钟的隔音候车室每次测试开始之前。 所有的实验（ 图2A）的应在s中被执行每天火焰的时间段中的光或暗相位以减少由在不同时间23,24测试所产生的行为变化。在这个协议中，所有的实验都是轻相和1小时发病的黑暗阶段（上午8:00至下午6:00在轻相）发病前1小时后之间进行。如果只有一个设备是可用的，每个基因型的小鼠，应在一个平衡，以减少试验时间和对行为表现受试者的测试顺序的潜在影响进行试验。 ImageFZ可以控制最多4个装置。同时测试4只小鼠用4设备的平衡才能使研究人员节省时间，降低了实验参数对小鼠行为的可能影响。 3。空调小鼠被放置在调节室和小鼠通常允许自由地探索该腔室为120秒。此后，非盟ditory球杆，例如白噪声，音调和听觉发声，是作为一个CS，持续30秒，最后2秒的声音的过程中0.1-0.8毫安电击被给予小鼠作为美国。在CS-US配对的呈现反复强化的关联。将小鼠留在腔室中的时间长度，最后介绍后，进一步建立该室的上下文和厌恶的经验之间的关联。在这个协议中，120秒的自由探索后，听觉提示（白噪声55 dB）被提出，持续30秒，并且一个0.3毫安电击的最后2秒的白噪声的过程中连续地传递。 90秒后，将听觉线索与电击的配对被再次提供给受试者。 CS-US的呈现重复每届3次（120，240，和360秒的调理开始后）（ 图2B）。以下最后的电击，将小鼠在腔室90秒静置。 调理会话开始之前，运行ImageFZ应用软件程序，选择插件菜单“FZ空调和FZ在线（4室）”，并设置参数值一步一步如下。 第1步：项目编号。指定要在其中存储数据文​​件的文件夹。 步骤2：会话名称。输入任何文字， 如实验数据，在“会话”对话框，然后选择其中的起始时间和白噪声和电击的时间都写，在“参考”框中键入一个参考的文本文件。样本的文本文件显示在视频。 第3步：参数设置。在每个方块中输入如下的参数值。 速度（帧/秒）：图像采集的帧率， 比如 1帧/秒。 持续时间（秒）：在空调的情况下，总的持续时间为480秒。 选区持续时间（秒）： 例如 60秒;的数据在每个块中进行分析的60秒。 主题大小 – 最小（像素）：ImageFZ检测到鼠标和噪声黑色颗粒（像素部分质量）在一个白色的背景在每个图像。当黑色颗粒（像素）的面积是小于“主题大小-分钟（像素数）”的值（ 例如 100像素）时，颗粒被视为噪声而被排除在图像分析。 被摄体尺寸 – 最大（像素）：当黑色颗粒的尺寸超过了“主题大小 – 最大（像素）'的尺寸值时，颗粒被从分析中排除。 帧大小-宽度/高度（厘米）：室尺寸， 即 33厘米宽和25厘米高。 冻结准则（像素）： 例如 30像素，看到协议6的细节。 冻结时间-分钟（秒）： 如 2秒，当检测到只有不到2秒无鼠标移动，其行为不算作“冻结”;。 冲击速度（帧/秒）：见协议6的细节。 第4步：主题标识。输入对象的识别。 步骤5：相机设置。控制亮度和所捕获的图像的对比度。 第6步：阈值设置。调整阈值来检测黑色的鼠标为黑色像素在白色背景中的每个图像，并判断鼠标行为为“冻结”或“非冻结”（见议定书6的细节）。分析白化鼠标点击复选框“反转模式”，并适当调整阈值。 第7步：设置网箱球场。指定你想要捕捉的每个室的领域。单击工具箱中的矩形按钮后，周围绘制实时图像窗口中室的地板的矩形。接下来，选择室号，然后单击“设置”按钮。最后，点击“完成”按钮。 <LI>后的参数设置选项，预备试验应采用的做法小鼠（不作为主题Mice）当天的先行先试，以确定图像分析系统和白噪音/震动发电机是否没有问题的工作给予。 移动包含实践小鼠对从相邻的候车室的隔音测试室一个家笼，然后将每只小鼠的调节室。立即把小鼠的室之后，单击ImageFZ的启动按钮。该应用软件将在您的参考文件中指定的顺序呈现听觉线索和/或电footshocks给小鼠。 后480秒已经过去时，返回的小鼠其家笼和笼返回到在保持室的架子上。 仔细清洁室。然后，单击“下一步分析”按钮，并重复步骤3.2.4-3.6对试验鼠。 ImageFZ店住和TIFF格式的图像跟踪。该计划允许我们执行脱机分析使用修改后的参数值来重新分析图像。如果你进行脱机分析，选择插件菜单中的“恐惧条件和FZ离线”，然后选择您要重新分析数据文件夹。此后，输入的参数值再次，然后点击“完成”按钮。 4。语境测试调理会话完成后，将小鼠返回到相同的调理室，并取得冻结行为来衡量语境条件恐惧（上下文测试）。调理和上下文测试之间的延迟间隔已被普遍设定为24小时。在这个协议中，以评估近期记忆和远期记忆25（由测试1天，调理后28天，分别测得），小鼠受到上下文测试约24小时，30天调理会议之后。将小鼠放置在已调节itioning室，并允许自由探索室为300秒，而没有CS和美国演讲（ 图2C）。 运行ImageFZ软件程序和以同样的方式设置了应用软件的参数值，如在调节（见3.2.3节），但是，修改该试验的持续时间为300秒，并选择上下文测试的参考文本文件。更改设置后，预备试验应采用的做法老鼠来检查ImageFZ系统给出。 将每只小鼠放入调理室，然后点击开始按钮。经过300秒过去后，返回小鼠到他们家笼，并留下笼原状，直到线索测试开始。 清洁室。然后，单击“下一步分析”按钮，并重复步骤4.3-4.4在试验小鼠。 5。线索测试线索测试上下文测试的当天或第二天进行。在该试验中，小鼠被放置到另一个测试腔室具有非常不同的特性，提供了一种新的上下文无关的调节室3分钟。在第一个3分钟结束时，即，提出了在空调时的听觉线索是给老鼠在小说的上下文环境中3分钟。在这个协议中，线索执行测试的上下文中试验后的几个小时。老鼠被允许探索三角形室360秒。在第3分钟，既不是CS，或是美国提出，此后，一个CS（一55分贝白噪声），提出在最后3分钟。 运行ImageFZ软件程序和设置的参数值中的相同方式在空调，除了修改测试的持续时间，以360秒，然后为线索测试的参考文本文件。调整设置后，预备试验应采用的做法老鼠来检查ImageFZ系统给出。 将每只小鼠放入三角腔，然后点击开始按钮。后360秒已经过去时，返回的小鼠其家笼和笼返回到收容室的架子上。 清洁室。然后，单击“下一步分析”按钮，并重复步骤5.3-5.4在试验小鼠。 为了进一步测试远程内存，空调会议（ 图2A）4-5后30天左右重复的协议。 6。图像分析自动使用ImageFZ进行数据采集和分析。该应用软件程序是基于公共领域的ImageJ程序（由韦恩Rasband在卫生部和国家机构可在http://rsb.info.nih.gov/ij/开发），由宫川刚修改（ImageFZ应用软件，可以免费下载，见表材料/试剂）。 对于所有实验，采集图像在使用USB视频捕获设备，包括一个给定的帧速率（ 例如 1帧）与ImageFZ视频摄像头。为了测量从连续的图像移动的距离，调整“门槛最小”值的程序（ 例如 80像素），它被设置为段影像变成了黑色颗粒（鼠标）和一个白色的背景。行进的距离从各组在xy间的距离的坐标为粒子的重心在连续图像的中心来计算。 为了测量从连续图像的冻结行为，调整“门槛分钟（XOR）价值的程序（ 例如 160像素），它被设置为段影像变成了黑色颗粒（鼠标）和背景，然后计算金额每对连续图像的颗粒之间不重叠区域的面积（像素）。使用阈值工具的滑块，直到黑色粒子在每个图像中的鼠标不包括​​尾部的整个身体的形状相匹配调整值。如果nonoverla的面积pping区域下方的“冷冻准则”的值（ 例如 30个像素），则该行为被认为是“冻结”（ 图3），其通常被定义为除了呼吸和心跳完全没有任何运动。当面积超过该值，则该行为被认为是“非冷冻'（ 图3）。判决应当根据冷冻的定义进行。老鼠有时表现出细微的动作和瞬间不动，这可能不被视为一个冻结行为，反映了恐惧。固定性，持续的时间很短（ 例如小于2秒），这是从恐惧的表现可能会有所不同，可以通过设置冷冻的时间阈值被排除在分析之外。要设置时间阈值，输入'冻结时间-分钟（秒）'的值（ 例如 2秒）。 该ImageFZ程序自动演算阿泰行驶的距离（厘米）和冷冻的百分比。结果保存在文本文件中，生活和跟踪图像存储在一个TIFF格式。为了测量行驶距离（厘米）电动电击敏感的指标，该ImageFZ方案还处于较高的帧速率（ 例如 4帧），持续6秒，2秒测量的2秒电击的交付前，直到2获取的图像秒内在线分析电击后。之前设置的帧频图像采集，期间和之后，电击，在输入一个值“冲击速度（帧/秒）”复选框。在线分析后，通过选择插件菜单中的“FZ冲击离线”，以获得行驶的距离数据进行离线分析。 该ImageFZ程序的参数值应进行优化，以产生类似的结果由人类观察者在预备测试中获得。对于手动得分，冻结行为不断使用stopwatc测H和事件记录程序或瞬时时间抽样程序每3-10秒，在此期间使用ImageFZ软件分析。两个观察者通常进行行为观察。要调整ImageFZ程序的参数值，以确保图像分析的结果是与人类观察者一致，执行ImageFZ程序的离线分析，修改了“门槛分钟（XOR）”和“冻结标准的价值观。为了进行离线分析，选择插件菜单中的“FZ离线'和输入任何参数值。 7。故障排除怎样才能ImageFZ程序获得并安装？ 该ImageFZ程序是可以从我们的网站免费下载（见表材料/试剂），并运行在Windows计算机上。下载zip文件夹ImageFZ和您的计算机上安装该软件。见'的readme.txt'文件的installati有关详细信息，并按照一步一步的指示。 为什么显示错误消息“错误的设置捕获设备”？ 检查摄像机电缆的连接和驱动程序安装的USB图像采集设备的。如果没有与该设置没有问题，那么ImageFZ软件可能无法与您的图像捕获设备正常工作。见关于相应的设备与ImageFZ软件使用'的readme.txt“文件。 ImageFZ不能检测到鼠标的整个身体的颗粒。 设置的“门槛分钟”和/或“门槛分钟（XOR）”比当前值小的值。如果ImageFZ不能检测到鼠标在一个特定的地方， 例如 ，一个测试室的角落里，然后测试条件不足，如一个均匀地照明的地板或鼠标和背景之间的反差稍微的差异，可能存在。为了解决这个问题，调整参数的值（ 例如 </eImageFZ的米>亮度和实时图像和阈值的对比），控制灯的数量和位置，或者使用白色背景的黑色的鼠标。 以高帧率图像拍摄过程中的在线分析会减慢计算机。 帧速率设定为比目前的速度低，并且执行在线分析。该ImageFZ分析，通过在1帧​​的图像采集，足以准确地测量冷冻，如图代表性结果部分。 该ImageFZ分析的结果不同意那些人的得分。 检查存储的图像和判断结果文件。如果ImageFZ高估冻结的'冻结准则“的值设置为大于当前值的情况下，与进行离线分析。如果ImageFZ低估冷冻的'冻结准则“的值设置为比当前值更高。 在optogenetical和体内电éxperiments，附着在小鼠头部的光纤电缆干扰冷冻的判断。 外套的电缆在白色的黑色的鼠标，改变相机的位置和角度，直到未检测到电缆。 什么是需要的离线分析？ 创建一个名为“Image_FZ”在ImageFZ程序的根目录文件夹。在这个文件夹中创建子文件夹“图片”和“会话”。移动8位灰度图像到“图片”文件夹，并创建了图像的文件名是写在“会话”文件夹中的文本文件。此后，运行ImageFZ离线分析，并按照程序的指示。