Vaststelling van de minimale bacteriedodende concentratie van een antimicrobieel middel voor planktonische cellen (MBC-P) en biofilmcellen (MBC-B)
Summary
Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die een biofilm in vitro kan vormen met behulp van een 96-put microtiterplaat. Planktonische of biofilmbacteriën worden blootgesteld aan seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze. De levensvatbaarheid wordt beoordeeld door de groei op agarplaten.
Abstract
Dit protocol maakt een directe vergelijking mogelijk tussen planktonische en biofilmresistentie voor een bacteriestam die in vitroeen biofilm kan vormen . Bacteriën worden ingeënt in de putten van een 96-wells microtiterplaat. In het geval van de planktonische assay worden seriële verdunningen van het antimicrobiële middel van keuze toegevoegd aan de bacteriële suspensuspensus. In de biofilmtest, eenmaal ingeënt, worden de bacteriën gedurende een bepaalde periode een biofilm laten vormen. Niet-gebonden cellen worden uit de putten verwijderd, de media worden aangevuld en seriële verdunningen van het antimicrobiële middel naar keuze worden toegevoegd. Na blootstelling aan het antimicrobiële middel worden de planktonische cellen voor groei afgetest. Voor de biofilmtest worden de media vernieuwd met verse media zonder antimicrobieel middel en worden de biofilmcellen achtergelaten om te herstellen. De levensvatbaarheid van biofilmcellen wordt na de herstelperiode beoordeeld. De MBC-P voor het antimicrobiële middel wordt gedefinieerd als de laagste concentratie van het medicijn dat de cellen in de planktonische cultuur doodt. De MBC-B voor een stam wordt daarentegen bepaald door voorgevormde biofilms gedurende 24 uur bloot te stellen aan toenemende concentraties antimicrobieel middel. De MBC-B wordt gedefinieerd als de laagste concentratie antimicrobieel middel dat de cellen in de biofilm doodt.
Introduction
Antibioticaresistentietesten werden aanvankelijk ontwikkeld om resistentie van planktonische (vrijzwemmende) bacterieculturen te testen. Omdat veel bacteriële infecties biofilms (aan het oppervlak gehechte cellen) omvatten, waren we geïnteresseerd in het ontwikkelen van een methode om biofilmspecifieke antibioticaresistentie te testen. De meeste antibioticaresistentietesten zijn echter slecht geschikt voor het meten van de resistentie van biofilms. Het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) is bijvoorbeeld de gouden standaard voor het bepalen van antibioticaresistentie van planktonische bacterieculturen 1. Deze test houdt in dat een verdunde planktonische cultuur wordt gemengd met een verdunningsreeks antibiotica. De concentratie antibioticum die de zichtbare groei van de planktonische cellen remt, is de MIC. Aangezien deze test afhankelijk is van remming van de groei, kan het per definitie niet werken met biofilmculturen, wat vereist dat de antibioticagevoeligheid van cellen in een voorgekweekte biofilm wordt onderzocht. In plaats van groeiremming te meten, bepaalt de hier beschreven MBC-B-test de concentratie antibioticum die cellen doodt die al in een biofilm bestaan. Deze test is dus bedoeld om antibioticabehandelingen van gevestigde biofilminfecties na te bootsen en een relevanter beeld te geven van de bacteriële antibioticaresistentie in vivo.
Aangezien biofilms over het algemeen antibioticaresistent zijn dan planktonische culturen 2-4, was het noodzakelijk om een methode te bedenken die de antibioticaresistentie van een biofilm rechtstreeks relateert aan die van een planktonische cultuur. Een ander doel van deze methode is dus om het niveau van antibioticaresistentie tussen planktonische en biofilmcellen direct te kunnen vergelijken. De hier beschreven MBC-P en MBC-B assays maken dit mogelijk omdat cellen onder vergelijkbare omstandigheden worden gekweekt. We hebben deze methode gebruikt om verschillende genen te bestuderen die belangrijk zijn voor biofilmspecifieke antibioticaresistentie 5-8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Antibioticaresistentie in planktonische cellen wordt gedefinieerd als een toename van de minimale remmende concentratie (MIC) van een antibioticum als gevolg van een permanente verandering in de cellen(bijv. een mutatie). De mechanismen van biofilmspecifieke resistentie of tolerantie die tot nu toe zijn geïdentificeerd, zijn het resultaat van de expressie van wilde genen in biofilms. De klassieke definitie van resistentie is dus niet van toepassing op biofilms. Er is echter een andere reeks definities gepresent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur wil Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz en Clayton Hall bedanken voor redactionele hulp bij dit manuscript. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld in het lab van George O’Toole, Geisel School of Medicine in Dartmouth. Onderzoek in het lab van Dr. Mah wordt ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en Cystic Fibrosis Canada.
Materials
|
1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
|
KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
|
|
K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
|
|
(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
|
|
Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
|
Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
|
|
Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
|
96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
|
Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
|
Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
