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Biology

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

Published: November 16, 2013
doi:
10.3791/50844
,
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute,University of Groningen

Summary

Polymerisation von FtsZ ist für bakterielle Zellteilung. In diesem Bericht haben wir ausführlich einfache Protokolle zu FtsZ Polymerisation Aktivitäten zu überwachen und zu diskutieren den Einfluss der Pufferzusammensetzung. Die Protokolle können verwendet werden, um die Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder antibakterielle Medikamente, die Polymerisation beeinträchtigen FtsZ untersuchen.

Abstract

Während der bakteriellen Zellteilung montiert der essentielles Protein FtsZ in der Mitte der Zelle, um den sogenannten Z-Ring bilden. FtsZ polymerisiert in lange Filamente in Gegenwart von GTP in vitro, und die Polymerisation wird durch mehrere Hilfsproteine ​​reguliert. FtsZ Polymerisation wurde ausgiebig in vitro unter Verwendung von Grundverfahren, einschließlich Lichtstreuung, Sedimentation, GTP-Hydrolyse-Assays und elektronenmikroskopisch untersucht. Pufferbedingungen beeinflussen sowohl die Polymerisation von FtsZ Eigenschaften und die Fähigkeit von FtsZ mit regulatorischen Proteinen interagieren. Hier beschreiben wir Protokolle für FtsZ Polymerisation Studien und bestätigen Auflagen und Kontrollen unter Verwendung von Escherichia coli und Bacillus subtilis als Modell FtsZ Proteinen. Eine niedrige Geschwindigkeit der Sedimentation Test wird eingeführt, die die Untersuchung der Wechselwirkung von FtsZ ermöglicht mit Proteinen, die zu bündeln oder tubulate FtsZ Polymere. Eine verbesserte GTPase-Assay-Protokoll beschrieben, das Testen ermöglichtGTP-Hydrolyse im Laufe der Zeit unter Verwendung von verschiedenen Bedingungen in einer 96-Well-Platte Aufbau mit standardisierten Inkubationszeiten, die Variation in der Farbentwicklung in der Phosphatnachweisreaktion aufzuheben. Die Herstellung der Proben für die Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie-Studien beschrieben. Mehrere Puffer werden verwendet, um die passenden Puffer pH-Wert und Salzkonzentration für FtsZ Polymerisation Studien zu etablieren. Eine hohe Konzentration von KCl ist das Beste für die meisten Experimente. Unsere Methoden stellen einen Ausgangspunkt für die in-vitro-Charakterisierung von FtsZ, nicht nur aus E. coli und B. subtilis, aber von einem anderen Bakterium. Als solche können die Verfahren für die Untersuchung der Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder die Prüfung der antibakteriellen Arzneimitteln, die FtsZ Polymerisation beeinflussen, verwendet werden.

Introduction

Der wesentliche bakterielle Protein FtsZ ist die am besten charakterisierte Protein der bakteriellen Zellteilung Maschinen. FtsZ ist die prokaryotische Homolog von Tubulin und polymerisiert in vitro in einer GTP-abhängigen Weise. FtsZ ist ein sehr attraktives Ziel für neue Antibiotika aufgrund seiner konservierten Natur und Einzigartigkeit, um Bakterien zu 1,2. Zu Beginn der Zellteilung bildet FtsZ eine zytokinetischen Ring midcell, das als Gerüst für die Montage der anderen Zellteilung Proteine ​​dient. Bildung der Z-Ring ist von entscheidender Bedeutung für die korrekte Lokalisierung der Trennungsebene. Die Montage Dynamik der FtsZ werden von mehreren Hilfsproteine, wie (je nach Bakterienarten) MinC, SepF, ZAPA, UgtP, und Esra 2 geregelt. FtsZ Polymerisation wurde intensiv in vitro und viele verschiedene Strukturen, einschließlich Protofilamenten gerade, gebogen Protofilamenten, Platten aus Filamenten, Bündel von Fäden und Rohre von Filamenten untersucht wurden described je nach Montagepuffer, Nukleotid, und zusätzliche Proteine ​​in dem Test 3 enthalten. Die Architektur des FtsZ Protofilamenten in vivo ist noch nicht vollständig verstanden, obwohl Elektronen cryotomography Experimente in Caulobacter crescentus vermuten, dass die Z-Ring ist aus relativ kurzen, nicht-kontinuierlichen Einzel Protofilamenten ohne umfassende Bündelung 4 montiert.

In vitro, die Polymerisation Eigenschaften FtsZ und die Interaktion von FtsZ mit regulatorischen Proteinen reagieren empfindlich auf die Zusammensetzung der Reaktionspuffer. Zum Beispiel kürzlich beschrieben wir die Interaktionsstelle für SepF am FtsZ C-Terminus und zeigte, daß ein FtsZ Bs Δ16 C-terminalen abgeschnittenen nicht mehr bindet SepF 5. In einer früheren Studie über die SepF-FtsZ Bs Interaktion, truncate eine ähnliche FtsZ Bs Δ16 noch mit SepF, die vorgeschlagen, dass SepF bindet an einen sekundären Standort auf FtsZ cosedimented <sup> 6. Der Unterschied zwischen diesen Studien war die Zusammensetzung der Reaktionspuffer bei pH 7,5-es gab keine cosedimentation von SepF mit der FtsZ abschneiden, während bei pH 6,5 war cosedimentation. Gündoğdu et al. SepF beachten, dass nicht funktions und fällt bei pH 6,5 7 zeigt, dass die beobachtete cosedimentation bei pH 6,5 wird wahrscheinlich durch Ausfällung SepF anstatt Wechselwirkung mit dem FtsZ Bs Δ16 C-terminalen abgeschnittenen verursacht werden. Der Einfluß des pH-Werts und KCl-Konzentration auf die Polymerisation von FtsZ zuvor untersucht worden. Polymere von E. coli FtsZ (FtsZ Ec) bei pH 6,5 sind länger und häufiger als bei neutralem pH-Wert 8,9 ist. Tadros et al. haben die Polymerisation von FtsZ Ec in Gegenwart von einwertigen Kationen Feststellung, dass K +-Bindung an FtsZ Ec Polymerisation verbunden und ist entscheidend für die Aktivität FtsZ 10 untersucht. Der pH-Wert ist critical, wenn die Wechselwirkung von FtsZ mit anderen Proteinen untersucht, wie im vorherigen Beispiel der SepF, und der pH-Abhängigkeit der Hemmwirkung von MinC auf FtsZ 11 gezeigt. Da beide pH-Wert und Salzkonzentration kann die Wechselwirkung von FtsZ mit anderen Proteinen beeinflussen, ist es wichtig, die richtigen Bedingungen und Kontrollen für die FtsZ Polymerisation Studien zu wählen.

Hier beschreiben wir Protokolle FtsZ Polymerisation und GTPase-Aktivität durch Lichtstreuung, Elektronenmikroskopie, Sedimentation und GTPase Assays zu untersuchen. Rechter Winkel Lichtstreuung ist eine Standardmethode, um FtsZ Polymerisation in Echtzeit 12 studieren. Wir führten ein paar Verbesserungen an der Sedimentation und GTPase-Assay. Wir präsentieren im Detail, wie Proben für die Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie vorzubereiten. Mehrere Puffer in der Literatur verwendet, um FtsZ Polymerisation zu untersuchen, wurden getestet und beschreiben wir die besten Voraussetzungen für jedes Experiment. Wir zeigen auch, welche sollte kontrollierteingeführt, um die besten Daten zu erhalten.

Diese Methoden ermöglichen eine schnelle Untersuchung der FtsZ Polymerisation, Aktivität und Interaktion mit anderen Proteinen mit einfachen Methoden und Geräte, die in den meisten Labors zur Verfügung steht. Weitere anspruchsvolle Methoden, um FtsZ Polymerisation studieren existieren, aber häufig Zugang zu spezialisierter Ausrüstung und / oder Verändern des FtsZ mit fluoreszierenden Markierungen 8,13,14. Die in diesem Dokument beschriebenen einfachen Methoden werden mit FtsZ aus B. dargestellt subtilis und E. coli, die häufigste Gram + und Gram-Modellorganismen. Die Protokolle können zu jedem anderen FtsZ Protein angepasst werden. Basierend auf ersten Tests mit diesen neuen FtsZs, leichte Veränderungen in Bezug auf Zeit-, Puffer-oder Temperatur der Inkubation kann, die für ein optimales Ergebnis sein. Die hier beschriebenen Experimente sollen in die Suche nach diesen optimalen Bedingungen zu unterstützen.

Protocol

Untagged FtsZ Proteine ​​wurden wie zuvor beschrieben gereinigt, 11,15, gegen 20 mM Tris / HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc und 10% Glycerol dialysiert und bei -80 ° C gelagert Unter diesen Bedingungen kann das Protein für mehr als 2 Jahren ohne signifikanten Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Das Protein ist in 100 &mgr; l Aliquots gelagert werden, Auftauen und Einfrieren der Probe zu vermeiden. Nach dem Auftauen kann die Probe bei 4 ° C für maximal eine Woche lang werden. FtsZ ist bei hohen Konzentrationen löslich und kann bei 7-10 mg / ml aufbewahrt werden. Es ist wichtig, um die Proteinkonzentration hoch zu halten, um unerwünschte Effekte der Speicherpufferkomponenten in späteren Experimenten vermeiden. Somit sollte Speicherkonzentration für eine Verdünnung von FtsZ von mindestens 10x ermöglichen Glycerinkonzentration unter 1% zu bringen und die Konzentration der anderen Komponenten der Dialysepuffer in der Reaktionsmischung zu minimieren. FtsZ Polymerisation kann auch durch die Anwesenheit von hohen Natrium 9 betroffen </sup> oder Imidazol-Konzentrationen so müssen diese Komponenten aus der Polymerisation Puffer entfernt werden. SepF wurde, wie beschrieben und in 7 Elutionspuffer bei -80 ° C gelagert gereinigt Alternative veröffentlichten Verfahren zur Reinigung von FtsZ aus E. coli und B. subtilis sowie Hinweise zu den Verfahren zur Reinigung von FtsZ aus verschiedenen Quellen sind in Tabelle 1 zusammengefasst (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt). 1. Probenvorbereitung Bereiten Polymerisation Puffer: 1 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5 2 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 3 50 mM MES / NaOH, pH 6,5 4 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 50 mM KCl 5 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 50 mM KCl 6 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 50 mM KCl 7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 300 mM KCl 8 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 300 mM KCl 9 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 300 mM KCl Filter sterilisieren alle Puffer mit einer 22 um Membranfilter. Bereiten 100 mM GTP, GDP und MgCl 2 Stammlösungen in jeder Polymerisation Puffer aus (1). Preclear Proteine ​​durch Zentrifugieren bei 100.000 g für 20 min bei 4 ° C für alle Experimente. 2. FtsZ Sedimentation Assay Bereiten Sie die Reaktionsmischung durch Zugabe von MgCl 2 und FtsZ zu einem der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung Punkt 1) in Rohren mit Highspeed-Zentrifugation kompatibel. Gesamtvolumen sollte 49 &mgr; l bei 12 &mgr; M in 50 &mgr; l Endvolumen zu sein, mit MgCl &sub2; auf 10 mM und FtsZ. Pschnüren das Rohr in einem Inkubator mit Schüttelfunktion, Inkubation für 2 min bei 30 ° C bei 300 rpm (alternativ kann die Probe leicht schnippte und kurz mikrozentrifugiert durch Vorwärmen bei 30 ° C, gefolgt). Starten der Polymerisation durch Zugabe von 1 &mgr; l GTP oder GDP-Stammlösung in dem gleichen Puffer wie im Experiment (Endkonzentration 2 mM) verwendet. Inkubation für 10 min oder 2 (für Puffer mit 50 mM KCl und 300 mM KCl, jeweils) bei 30 ° C mit 300 Upm (oder in einem Inkubator unter Schütteln Funktion). Übertragen Sie die Rohre auf einer Ultrazentrifuge Rotor-und Spin-down für 10 min bei 350.000 xg (89.700 rpm für TLA 120.1 Rotor) bei 25 ° C Nach dem Spinnen sorgfältig die Rohre zu entfernen aus dem Rotor und sofort den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Vorbereitung Proben für SDS-PAGE durch Zugabe von 20 &mgr; l Überstand und 20 ul 2x Probenpuffer. Die Mischung 10 min bei 98 ° C. In 50 ul 2x Probenpuffer zum Pellet Fraktion, Ftsz Polymere. Legen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in einem 2-ml-Tube. Das Pellet durch Kochen für 10 min bei 98 ° C, dann fügen Sie 50 ul demineralisiertem H 2 O, um die Probe die gleiche 2x Verdünnung als Überstand Probe zu machen. Drehen Sie den Ultrazentrifugenröhrchen kopfüber in der 2-ml-Tube und Spin-Down für 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 18.000 x g. Entfernen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen aus der 2-ml-Tube. Last 10 &mgr; l jedes Überstands-und Pelletprobe nebeneinander auf einem 10% SDS-PAGE-Gel. Führen Sie das Gel bei 150 V Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue G-250 und halten für die Quantifizierung. 3. FtsZ Sedimentation Assay bei Slow-Spin Bereiten Polymerisation Lösung wie in Schritt 2, fügen SepF und / oder FtsZ (Endkonzentration 12 uM). Diese Versuche können in Beckman Einweg 1,5-ml-Röhrchen in Kombination mit einem Rotor TLA-55 durchgeführt werden. Das Röhrchen wird in einem Brutschrank unter Schütteln funktion und Inkubation für 2 min bei 30 ° C bei 300 UpM. Starten der Polymerisation durch die Zugabe von 1 &mgr; l GTP oder GDP aus einer Stammlösung (Endkonzentration 2 mM), Inkubation für 20 min bei 30 ° C bei 300 UpM. Spin down für 15 min bei 24.600 xg (20.000 rpm für TLA 55 Rotor) bei 25 ° C Entfernen Sie den Überstand und Überführung in ein sauberes Röhrchen, nehmen Sie 20 ul und Transfer in 20 ul 2x Probenpuffer. Die Mischung 10 min bei 98 ° C. Dann werden 50 ul 2x Probenpuffer zu pelletieren Fraktion enthaltende Polymere und resuspendieren durch Kochen für 10 min bei 98 ° C, 50 &mgr; l demineralisiertem H 2 O. Last 10 &mgr; l jedes Überstands-und Pelletprobe nebeneinander auf einem 10% SDS-PAGE-Gel. Führen Sie das Gel bei 150 V Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue G-250 und halten für die Quantifizierung. 4. Die Quantifizierung der FtsZ Sedimentation Assays Machen Sie ein Foto des Coomassie stained Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem (zB LAS-4000, Fujifilm). Öffnen Sie das Bild in einem Gel eignet sich für densitometrische Analyse von Gelen (zB AIDA Bildanalyseprogramm (Raytest))-Programm und zu beschreiben Analyse in diesem Programm unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Auswertung" in der Symbolleiste. Wählen Sie die "2D-Densitometrie" aus der Liste und klicken Sie auf OK. Im Hauptmenü, klicken Sie auf "Auswertung" und wählen Sie die "Region Bestimmung"-Eintrag. Um eine Region auf dem Gel zu erstellen, klicken Sie auf das Symbol der Auto-Kontur-Werkzeug in der Region Bestimmung Toolbox. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Protein-Bande auf dem Gel, halten Sie die Maustaste gedrückt und ziehen Sie es an die gewünschte unteren rechten Ende der Band und lassen Sie die Maustaste los. Filter jeweils FtsZ / SepF Band in der gleichen Weise. Alle Informationen über die Bewertung der zugeordneten Bereiche können in der Region Bericht. Um die Regio erhaltenn Bericht auf die Schaltfläche "Region anzeigen Report" in der Region Bestimmung Toolbox. Um den Bericht zu exportieren, auf dem Hauptmenü, klicken Sie auf Datei und wählen Sie "Export à 2D-Region Report"-Eintrag. In der Region Bericht sollte die Intensität von jedem erstellt Region. Der prozentuale Anteil an Protein (FtsZ, regulatorische Protein) im Pellet mit den Intensitätswerten aus dem Bericht. 5. 90 °-Lichtstreuung Schalten Sie einem Fluoreszenzspektrometer (zB AMINCO-Bowman Series 2), die Lampe zum Aufwärmen für mehrere Minuten, um Temperaturschwankungen zu vermeiden und drehen auf einem umlaufenden Wasserbad auf die Küvette Raumtemperatur bei 30 ° C zu halten Bestimmen die Betriebsparameter des Spektrometers: Hochspannungsdetektor 300 V, Emissions-und Anregungswellenlänge: 350 nm, Spaltbreite: 4 nm aufweist. Beachten Sie, dass viele Spektrometer das Signal automatisch einstellen zu Beginn eines Experiments zu einer certain Prozent (z. B. 60%) der maximalen. Dies führt zu einer Streusignal, so bald wie GTP wird hinzugefügt, um FtsZ polymerisieren außer Reichweite zu gehen. Es ist ratsam, zunächst die richtige Signalverstärkung-Detektor-Hochspannung für die maximale Polymerisation zu etablieren, bevor eine Reihe von Experimenten. Programmieren Sie eine Datenerfassungs-Protokoll. Wählen zeitbasierte Erfassung, mit einer Dauer von 3,600 Sekunden. Ein Fluoreszenz-Küvette sorgfältig reinigen mit Wasser und Ethanol, falls erforderlich-beschallen im Wasserbad bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Protokoll Küvetten mit einer Weglänge von 1 cm und einer 200 &mgr; l-Volumen verwendet wurden und in der Speicherlösung (0,5-1% Hellmanex) gespeichert. Als Alternative können einzelne Verwendung UV-kompatiblen Kunststoffküvetten (UVette, Eppendorf) verwendet werden. Bereiten Sie 294 ul einer Master-Mix der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung Punkt 1) mit 10 mM MgCl 2 und 12 uM FtsZ als endgültige Konzentration für 300 ul berechnet und VORTex. Transfer 196 ul der Polymerisation Puffer in die Küvette und es in Spektrometers. Inkubation für 2 min bei 30 ° C. Starten Sie die Datenerfassung und warten 90 Sekunden um sicherzustellen, dass das Signal stabil ist. Hinzufügen von 100 &mgr; l 4 mM GTP oder GDP (Endkonzentration: 2 mm), um einen endgültigen Reaktionsvolumen von 200 &mgr; l zu erreichen, und Abpipettieren mit einem größeren Volumen Pipette zu mischen und wieder Erfassung. 6. Transmissionselektronenmikroskopie Proben nach Vorschrift vorbereiten für die FtsZ Sedimentation Assay (das Volumen auf 10 ul endgültige Volumen reduziert werden, um Material zu sparen). Nach der Inkubationszeit gelten 2 ul der Probe auf einem Schein-entladen 400 mesh Kohlenstoff beschichteten Kupfernetz, die Proben für 15 Sekunden. Tupfen Sie das Gitter trocken durch leichtes Berühren oder ziehen das Netz parallel oder senkrecht auf ein Stück Filterpapier. Färben Sie das Raster mit 4 ul einer 2% Uranyl-Acetat-Lösung. Blot das Raster trocken wie in Schritt 6.3 beschrieben. Sehen Sie das Gitter in einem Philips CM120 Elektronenmikroskop bei 120 kV bei 39.200-facher Vergrößerung. 7. GTP-Hydrolyse-Assay Der Aufbau des Experiments ist in der Weise, dass die GTP-Hydrolyse von FtsZ nach verschiedenen Reaktionszeiten, indem die Reaktion mit Malachitgrün gestoppt gestalten. Auf diese Weise ist die Zeit der Farbentwicklung von Malachitgrün die gleiche für jede Probe. Bereiten Sie 1,5 ml 2 mM GTP in einem der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung, Punkt 1). Bereiten Sie eine 0-40 uM Phosphat Standardverdünnungspuffer in einer Polymerisation und bereiten Arbeits Malachitgrün-Reagenz in der POMG-25H (Bio-Assays) Kit beschrieben. Alternativ können Arbeitsreagenzien im Haus nach durch Lanzetta et al. Protokolle 16 beschrieben vorbereitet werden Bereiten Master-Mixe in einem Gesamtvolumen 360 ul: <tableborder = "1"> Ich 24 uM FtsZ Bs, 20 mM MgCl 2, Polymerisationspuffer II 12 uM FtsZ Ec, 20 mM MgCl 2, Polymerisationspuffer III (Kontrolle 1) 24 uM FtsZ Bs, 2 mM EDTA, Polymerisationspuffer IV (Kontrolle 2) 12 uM FtsZ Ec, 2 mM EDTA, Polymerisation Puffer Je 20 ul Aliquots der Master-Mixe, 100 ul Phosphat-Standards und 180 ul von 2 mM GTP in einem qPCR 96-Well-Platte in der folgenden Reihenfolge: A B C D E F G H 1 III III Ich Ich IV IV </td> II II 2 III III Ich Ich IV IV II II 3 III III Ich Ich IV IV II II 4 III III Ich Ich IV IV II II 5 III III Ich Ich IV IV II II 6 III III Ich Ich IV IV II II 7 III III Ich Ich IV IV II II </ Tr> 8 III III Ich Ich IV IV II II 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP PS – Phosphat-Standard Legen Sie die qPCR Platte in einer PCR-Maschine mit dem Programm, um 40 min-Takt auf 30 ° C eingestellt Es werden 20 ul Aliquots von malachite grünen Arbeits Reagenz in einer 96-Well-Platte. Man gibt 60 &mgr; l der Polymerisation Puffer aus dem Experiment Spur 1'-8 '. Die Probe wird verdünnt 4x im Vergleich zu den Phosphat-Standard werden, beachten Sie bitte diese Tatsache während der abschließenden Berechnungen. A B C D E F G H 1 ' III III Ich Ich IV IV II II 2 ' III III Ich Ich IV IV II II 3 ' III III Ich Ich IV IV II II 4 ' <td> III III Ich Ich IV IV II II 5 ' III III Ich Ich IV IV II II 6 ' III III Ich Ich IV IV II II 7 ' III III Ich Ich IV IV II II 8 ' III III Ich Ich IV IV II II 9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS 10 ' PS </td> PS PS PS PS PS PS PS In 20 ul von GTP zu Spur 1, Pipette auf und ab zu mischen, Timer starten (dies ist der Startzeitpunkt für die 30-min-Reaktion). Nach 10 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 2, Pipette auf und ab zu mischen (20 min Reaktion). Nach 16 min hinzufügen GTP zu Spur 3, Pipette auf und ab zu mischen (15 Min. Reaktion). Nach 21 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 4, Pipette auf und ab zu mischen (10 min Reaktion). Nach 25 min hinzufügen GTP zu Spur 5, Pipette auf und ab zu mischen (7 min Reaktion). Nach 27 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 6, Pipette auf und ab zu mischen (5 min Reaktion). Nach 29 min hinzufügen GTP zu Spur 7, Pipette auf und ab zu mischen (4 min-Reaktion) .. Nach 30 min Transfer 20 ul von Bahn 1 in Spur 1 ", einer Pipette auf und ab zu mischen (Ausgangspunkt von Malachitgrün Farbentwicklung für die drei0 min-Reaktion). Nach 30 min, 30 sec Transfer 20 ul von Spur 2 bis 2 ', Pipette auf und ab zu mischen (Ausgangspunkt von Malachitgrün Farbentwicklung für die 20-min-Reaktion). Wiederholen Sie den Schritt für alle 30 Bahnen 3-7 sek. Nach 33 min, 30 sec mit 20 ul von GTP zu Spur 8, Pipette auf und ab zu mischen und übertragen 20 ul zu Spur 8 ', Pipette auf und ab, um zu mischen (0 min-Reaktion und Startzeitpunkt für Malachitgrün Farbentwicklung Die Reaktion). Nach 34 min werden 80 ul von Spur 9-9 ', Pipette auf und ab zu mischen (den Startzeitpunkt für Malachitgrün Farbentwicklung für die Phosphat-Standard 1). Nach 34 min 30 sec Transfer 80 ul von Spur 10 bis 10 ", einer Pipette auf und ab zu mischen (den Startzeitpunkt für die Malachitgrün Farbentwicklung für die Phosphat-Standard 2). Entfernen Sie alle Luftblasen aus den Proben und Inkubation der Platte bei Raumtemperatur für weitere 25 min30 sek. Die Platte wird in 96-Well-Plattenlesegerät. Nach 60 min messen die Platte 10x alle 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 630 nm (Malachitgrün Farbentwicklung ist jetzt 30 Minuten für die erste Reaktion). Jede Messung entspricht jedem Zeitpunkt aus den Schritten von 7,6 bis 7,12 und 7,16 und muss während einer Datenanalyse gesondert berechnet. Berechnen Sie die freie Phosphat in jeder Probe unter Verwendung des Standard-Phosphat-Eichkurve. Zeichnen Sie die Daten als Phosphat Freisetzung über die Zeit, und berechnen Sie die FtsZ GTP-Hydrolyse-Aktivität aus dem linearen Bereich der Kurve.

Representative Results

Reinigung von FtsZ aus verschiedenen bakteriellen Quellen ist in der Literatur beschrieben worden und ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Quelle Verfahren Änderung Ausbeute [mg / l Kultur]> Referenzen B. subtilis 1) Ammoniumsulfat-Fällung / Ionenaustausch-Chromatographie nicht 40 Diese Arbeit, 11,15 2) Die Affinitätschromatographie His-Tag ND 17 E. coli 1) Ammoniumsulfat-Fällung / Ionenaustausch-Chromatographie nicht 35 Diese Arbeit, 11,15 2) Calciumfällung, Ionenaustauschchromatographie nicht 40 18 <td> Methanococcus jannaschii 1) Die Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen / Rückfaltung / Ammoniumsulfat-Fällung / Gel-Filtration His-Tag 1.3 19 2) Die Affinitätschromatographie / Gel-Filtration His-Tag ND 20 Thermotoga maritima Ionenaustausch-Chromatographie / Gel-Filtration nicht 6,7 19 Pseudomonas aeruginosa Affinitäts-Chromatographie / Gel-Filtration Strep-Tag, His-Tag ND 21 Mycobacterium tuberculosis 1) Affinity / Ionenaustausch-Chromatographie nicht ND 22 2) Die Affinitätschromatographie / Gel-Filtration nicht 30 </td> 23 Aquifex aeolicus Affinitäts-Chromatographie / Gel-Filtration His-Tag-, C-terminale Verkürzung (331-367) ND 24 Caulobacter crescentus Ionenaustausch-Chromatographie / Ammoniumsulfat-Fällung / Gel-Filtration nicht ND 25 Tabelle 1. FtsZ Reinigungsprotokolle beschrieben. ND: nicht bestimmt. Sedimentation von FtsZ Polymere Zunächst verwendeten wir zwei verschiedene Geschwindigkeiten zu FtsZ Polymere Spin-Down. Wir fanden, dass nur mit einer Geschwindigkeit von 350.000 xg einzelnen Polymere der FtsZ Ec nach unten (Abbildung 1) gesponnen, während bei 190.000 xg nur Bündel von FtsZ Bs in der Pelletfraktion (Daten nicht gezeigt) vorhanden sind. Daher wurde 350.000 xg in unserem Fell verwendetther Experimenten. Der Anteil der polymerisierten FtsZ Ec und FtsZ Bs ist ähnlich bei 50 mM KCl, auch wenn die Lichtstreuung Experimente zeigten eine viel höhere Streusignal für FtsZ Bs. Dies ist aufgrund Bündel von FtsZ Bs gebildet, die mehr Licht als einzelne Polymere von FtsZ Ec streuen. Es war nicht möglich, eine hohe Menge von FtsZ Polymere in der Pelletfraktion in dem Experiment mit 300 mM KCl sowohl für FtsZ Ec und FtsZ Bs (Abbildung 1) zu erhalten. Wir führen dies auf eine Kombination von schnellen Demontage der FtsZ Strukturen und verringerte Bündelung der Filamente. Sedimentation von FtsZ-SepF Tubuli Um die Interaktion von FtsZ mit bestimmten Aktivatoren Sedimentation Tests können bei niedrigeren Geschwindigkeiten Zentrifugation durchgeführt werden, zu analysieren. Bei dieser Geschwindigkeit nur die großen Strukturen der FtsZ kann pelletiert werden, z. B. durch die großen Tubuli SepF gebildet klingelt eind FtsZ Filamente Bs 5, oder die von FtsZ und ZAPA gebildet Bundles. Wir verwendeten unteren Zentrifugation (24.600 × g), um die Machbarkeit dieses Ansatzes für die von FtsZ und SepF gebildet Tubuli demonstrieren. FtsZ im Pellet über Hintergrundgehalte gewonnen, wenn beide SepF und GTP in der Probe vorhanden ist (Fig. 2) sind, und die Anwesenheit von SepF nicht beeinflusst FtsZ GTPase-Aktivität 7 zeigt, dass FtsZ in Gegenwart SepF voll aktiv. Spezifische Sedimentation SepF und FtsZ ist in etwa 45% der Gesamt SepF und 15% der Gesamt FtsZ (im Vergleich zu sedimentieren Material, als das BIP wird hinzugefügt). Dies zeigt, dass die SepF FtsZ-Tubuli enthalten mehr als SepF FtsZ. Das kann sein, weil viele SepF Ringe organisieren die FtsZ-SepF Tubuli 5,7. Die genaue Stöchiometrie SepF-FtsZ in diesen Röhren ist nicht bekannt, aber unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mehr als FtsZ SepF vorhanden. FtsZ Ec und FtsZ Bs polymerizatIonen-und Bündelungseigenschaften Um die Effizienz der Polymerisation von FtsZ Bs und FtsZ Ec in verschiedenen Puffern analysierten wir beide Proteine ​​um 90 ° Winkellichtstreuung zu charakterisieren. Bei 50 mM KCl, gibt FtsZ Bs 20-40-fach höhere Lichtstreuung als Signal FtsZ Ec je nach pH-Puffer (3A und B) bestätigt Ergebnisse der Buske et al. 26. Erhöhung der KCl-Konzentration im Puffer nicht signifikant Einfluss der Lichtstreuungssignal FtsZ Ec (Fig. 3D), aber das Signal von FtsZ Bs verringert ~ 80-fach bei pH 7,5 ~ 30-fach bei pH 6,8 und ~ 45-fach bei pH 6,5 in 300 mM KCl (Fig. 3C) gegen mit 50 mM KCl (Fig. 3A) puffert. Zerlegen FtsZ Polymere schneller bei höheren KCl-Konzentration für beide Proteine ​​(3C und D </strong>). Studium der Pacheco-Gómez et al. zeigen, dass E. coli FtsZ Polymerisation und Bündelung ist pH-abhängig. Die Autoren fanden heraus, dass in einem Puffer mit 50 mM KCl das Lichtstreusignal von FtsZ Polymerisation war höher, und Demontage von FtsZ dauerte länger bei pH 6,0 im Vergleich zu pH 7,0 8. Diese Ergebnisse sind nicht in Übereinstimmung mit unseren Daten aus der Polymerisation von FtsZ Ec bei 50 mM KCl (3B), aber es ist zu beachten, dass wir drei verschiedene Puffer (HEPES, MES und Rohre) eingesetzt werden, wo Pacheco-Gómez et al. nur verwendet werden, MES. So wirkt sich nicht nur der pH-Wert, sondern auch Puffer-Zusammensetzung (Ionenstärke) die Kinetik der FtsZ Polymere bei 50 mM KCl. Allerdings bei 300 mM KCl weder Pufferzusammensetzung noch pH-Wert in einer nachweisbaren Weise beeinflusst FtsZ Ec Montage. Ein Lichtstreuung Experiment von FtsZ Bs in Puffer ohne KCl war nicht möglich, da eine Ausfällung des protein unter diesen Bedingungen. Wenn die Konzentration des FtsZ B wurde auf 3 &mgr; M verringert wird, hat Präzipitation nicht auf. Jedoch ist 3 &mgr; M nicht die physiologische Konzentration von FtsZ in der Zelle. In Kunststoff-Küvetten hat FtsZ Bs nicht bei 12 &mgr; M bei pH 7,5 ausgefällt, aber bei pH 6,8 und 6,5 FtsZ noch in Abwesenheit von KCl gefällt. Morphologien von FtsZ Strukturen aus E. coli und B. subtilis Die von FtsZ gebildeten Strukturen wurden durch TEM untersucht. FtsZ Bs montiert in eng verdichtet Polymere, die das gesamte Netz in allen Puffern bei niedrigen Salz (Abb. 4A-C) abgedeckt. FtsZ Ec gebildet lange Fäden, Kabel und Bündel in allen Puffern bei niedrigen Salz (Abb. 4D-F). Allerdings ist die Menge der beobachtbaren Polymere durch FtsZ Ec gebildet wurde, war niedriger als die von FtsZ Bs gebildete Menge. In der Hochsalzpuffer mehr gebildet FtsZ BsEinzelstrang-Protofilamenten, die nicht in Bündeln zu assoziieren hat (Abb. 4G-I). Während FtsZ Bs Protofilamenten verändert Struktur bei höheren Salzkonzentration gebildet FtsZ Ec Strukturen nicht von denen der Niedrigsalzpuffer (Abbildungen 4J-L). Es gab keine beobachtbaren pH Einfluss auf die Polymerisation von FtsZ Ec aber FtsZ Bs bildet mehrere Bündel bei pH 6,5, die so genau verdichtet Polymere und Blätter (4B) sichtbar sind. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unserer Lichtstreuung und TEM bisher veröffentlichten Arbeit 8,11,26. Die GTPase-Aktivität von FtsZ bei hohen und niedrigen Konzentrationen KCl Die GTP-Hydrolyse-Aktivität von FtsZ wurde unter verschiedenen Bedingungen mit einem Farbtest für freie Phosphat gemessen. Wie berichtet bisher 15 der GTPase-Aktivität von FtsZ mit steigender KCl concentration: je nach dem verwendeten Puffer FtsZ Bs. zeigte eine 3-7 fache Erhöhung und FtsZ Ec zeigten eine 1,5-2,5 fache Erhöhung der GTPase-Aktivität bei 300 mM KCl im Vergleich zu 50 mM KCl. Die reduzierte GTPase-Aktivität bei 50 mM KCl ist auf Bündelung von FtsZ Bs Filamente. Bei 50 hatte mM KCl FtsZ Ec eine 6.3-fach höhere Aktivität als GTPase FtsZ Bs durch schnellere Demontage der FtsZ Ec Polymere. Der Unterschied in der GTP-Hydrolyse-Aktivität zwischen FtsZ Bs und FtsZ Ec wurde bei 300 mM KCl, möglicherweise aufgrund der reduzierten Bündelung der Filamente FtsZ B (Fig. 5) reduziert. Fig. 1 ist. Quantifizierung FtsZ Polymerisation durch Sedimentation. (A) 12 uM FtsZ wurde in Gegenwart von 2 mM GTP oder polymerisierteBIP bei pH 7,5 (schwarze Balken), 6.8 (graue Balken) oder 6,5 (weiße Balken). Die Menge an Protein wurde pelletiert durch densitometrische Analyse von Coomassie-gefärbten Gelen bestimmt. BIP diente als Kontrolle für eine spezifische Sedimentation und der Prozentsatz der FtsZ BIP sedimentiert wurde aus dem Prozentsatz der FtsZ mit GTP sedimentiert, um die Werte in der graphischen Darstellung aufgetragen bekommen subtrahiert. Links: FtsZ bei 50 mM KCl sedimentiert, rechts: FtsZ bei 300 mM KCl sedimentiert. (B) Repräsentative Ergebnisse aus Coomassie gefärbten Gelen. Polymerisation von FtsZ Bs (obere Gel) und FtsZ Ec (untere Gel) bei 50 mM KCl. (S) Überstand (P) Pellet-Fraktionen aus dem Experiment. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . Figure 2. Sedimentation von SepF / FtsZ Tubuli mit geringer Geschwindigkeit. (A) 12 uM FtsZ Bs wurde mit 2 mM BIP (weiße Balken) oder GTP (schwarze Balken) polymerisiert. Die Menge an Protein wurde pelletiert durch densitometrische Analyse von Coomassie-gefärbten Gelen bestimmt. Die Zeichen + und – im Rahmen der x-Achse auf das Vorhandensein oder Fehlen von FtsZ und SepF in der Reaktion. (B) Repräsentative Ergebnisse aus einer Coomassie gefärbten Gel. Polymerisation von FtsZ Bs in Gegenwart und Abwesenheit von SepF. Als eine Kontrolle ohne SepF FtsZ verwendet wurde. Die Polymerisation wurde mit GTP und GDP durchgeführt. (S) Überstand (P) Pellet-Fraktionen aus dem Experiment. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . 3. Licht Streuung von 12 uM FtsZ Ec und 12 uM FtsZ Bs. FtsZs wurden in Gegenwart von 2 mM GTP und Polymerisation gebaut wurde durch 90 ° Lichtstreuung verfolgt. Polymerisation von FtsZ B (A) und FtsZ Ec (B) bei 50 mM KCl bei pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Polymerisation von FtsZ Bs (C) und FtsZ Ec (D) bei 300 mM KCl bei pH 7,5, pH 6,8 und pH 6,5. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . 4. Strukturen von FtsZ Bs und FtsZ Ec Polymere, die durch Elektronenmikroskopie sichtbar. (AL) Bilder von 12 uM FtsZ Bs (AC </strong> und GI) und FtsZ Ec (DF) und (JL) mit 2 mM GTP polymerisiert. (AC) FtsZ Bs in Puffer mit 50 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. (DF) FtsZ Ec in Puffer mit 50 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 sind. (GI) FtsZ Bs in Puffer mit 300 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. (JL) FtsZ Ec in Puffer mit 300 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. Maßstab:. 100 nm Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . 5. GTP-Hydrolyse während FtsZ Polymerisation in 6 verschiedenen Puffern. In allen Experimenten 2 mM GTP wwie gewohnt. Als eine Kontrollprobe ohne MgCl 2 verwendet wurde. Aktivität FtsZ ohne MgCl 2 wurde aus den von FtsZ in Gegenwart von MgCl 2 subtrahiert. Auf der linken Seite: GTPase-Aktivität von FtsZ bei 50 mM KCl, rechts:. GTPase-Aktivität von FtsZ bei 300 mM KCl Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, die eine schnelle Analyse der FtsZ-Aktivität und seine Wechselwirkung mit anderen Proteinen ermöglicht. Lichtstreuung, Sedimentation und GTPase Assays sowie Elektronenmikroskopie wurden häufig verwendet, um FtsZ Polymerisation zu untersuchen. Wir haben einige Verbesserungen an bestehenden Protokollen gemacht, zeigten wir den Einfluss verschiedener Bedingungen auf FtsZ Montage, und wir schlagen Steuerelemente, die in FtsZ Studien aufgenommen werden sollten.

Wir stellen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, die von der Verbindung zwischen FtsZ und seine interagierenden Proteinen aus FtsZ Polymeren gebildet große Strukturen zu unterscheiden. Diese Methode zeigt zwei Vorteile gegenüber dem Standard-Sedimentation Assay. Zunächst wird kein Hintergrund der FtsZ Polymere in der Pelletfraktion gebildet, da sie nicht nach auf 24.600 x g zentrifugiert. Zweitens kann die Menge des in der FtsZ mit einem interagierenden Protein gebildete Struktur vorhanden aus dem Gel berechnet. Zwei kritische Schritte in diesem Verfahren sind die INCUBATIonen-Zeit und die GTP-Konzentration. Es ist wichtig, um die große Proteinstruktur zu zentrifugieren, wenn es abgeschlossen ist, aber bevor es zerlegt, wenn alle GTP hydrolysiert. Die beste Kontrolle für diese Studie ist die Polymerisation von FtsZ mit BIP. Es ist eine mögliche Beschränkung des Assays. FtsZ bildet einen stabilen Komplex mit SepF, die leicht nach unten auf 24.600 x g gesponnen werden kann. Wenn die Sedimentation mit einem anderen Aktivierungsmittel oder ein Medikament, das FtsZ Polymere Bündel durchgeführt wird, kann es notwendig sein, um den Assay anzupassen. Es kann durch Änderung der Inkubationszeit oder der Erhöhung der Geschwindigkeit der Zentrifugation erfolgen.

Die richtige Vorbereitung der Probe ist das wichtigste für Lichtstreuung wichtig. Proteine ​​müssen von Spinnvorgeklärt werden, und alle Puffer sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Wenn irgendwelche Aggregate in der Probe vorhanden sind, werden sie eine von FtsZ Polymere erhalten stabiles Signal zu stören. Für die Analyse der FtsZ Strukturen durch Elektronenmikroskopie wurde die Herstellung eines Gitter is die wichtigste Schritt. Die Zeit der Inkubation Probe auf dem Gitter wird die Wirkung der Herstellung von mehr oder weniger verdichtet Polymere. Zum Bündeln von FtsZ Bs, muss die Inkubationszeit kürzer als für FtsZ Ec und FtsZ Bs bei hohen KCl-Konzentration sein. Wir verwendeten eine Konzentration von 12 &mgr; M für jede Probe, um die Ergebnisse zu vergleichen. Für FtsZ Bs bei 50 mM KCl eine untere FtsZ Konzentration verwendet werden, wie 12 &mgr; m führte zu einer vollständigen Sättigung des Gitters. Dies macht die Polymere hoch verdichtet und schwer zu erkennen. Weniger verdichtet Polymere sind besser, sich auf EM zu erkennen.

Die GTPase-Assay ist der einzige Versuch verwendet, um die Aktivität anstatt den Strukturen FtsZ studieren. Mg 2 + ist für die GTP-Umsatz in FtsZ Polymere erforderlich. Somit wird in der Abwesenheit von Mg 2 +, FtsZ nicht hydrolysieren GTP. Daher ist eine Probe ohne Mg 2 + die richtige Kontrolle in diesem Assay jedoch Kationen Mg vorhanden sindFtsZ in der Speicherpuffer. Sie können durch Zugabe von 1 mM EDTA mit der Kontrollprobe entfernt werden. Der kritische Schritt in diesem Assay ist die Inkubationszeit. Es ist wichtig, FtsZ-Aktivität nach einer bestimmten Zeit zu stoppen. Dies wird durch die Übertragung der Probe auf ein FtsZ Malachitgrün-Lösung in einer 96-Well-Platte erreicht. Jedoch ist die Entwicklung von Malachitgrün Farb ein kontinuierlicher Prozess. Somit müssen die Messungen in der gleichen Zeit für jede Probe entnommen werden. Mit einem gut geplanten GTP-Protokoll zusätzlich mit Messungen auseinander in einer festgelegten Reihenfolge genommen jede 30 Sekunden, ist es möglich, die gleiche Inkubation und Probenbearbeitungszeit für jeden Zeitpunkt zu erhalten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Wahl der Konzentration des Proteins, für das Experiment. Bei dem Experiment verwendeten wir zwei unterschiedliche Konzentrationen für FtsZ Ec und FtsZ Bs. GTP-Hydrolyse ist viel schneller für FtsZ Ec Vergleich zu FtsZ Bs. Die GTPase-Aktivität von FtsZ Ec unter gewählten Bedingungen und12 uM linear ist nur für maximal 5 min und nach dieser Zeit der Hydrolysegeschwindigkeit Plateaus. Somit ist es schwierig, Daten aus dem Experiment zu interpretieren, wenn sie unter diesen Bedingungen durchgeführt. In diesem Fall muss FtsZEc bei niedrigeren Konzentration als FtsZ B verwendet werden, um Aktivitäten der beiden Proteine ​​zu vergleichen. Die GTPase-Aktivität von FtsZs aus verschiedenen Quellen kann variieren. Somit muss die richtige Konzentration ausgewählt werden. Die Konzentration für FtsZ Polymerisation sollte deutlich über der kritischen Konzentration (in der Regel 2,5 bis 10 uM) sein. Die Dynamik FtsZ Montage und Demontage ist auch wichtig. Einige Proteine ​​zeigen eine signifikante Verzögerung in der Polymerisation nach Zugabe von GTP, wie FtsZBs bei 50 mM KCl gezeigt. Es ist nützlich, um die Lichtstreuungstest vor der GTPase-Assay durchzuführen, um die Zeit der Montage und Demontage von FtsZ Polymere nähern. Danach kann die Inkubationszeit und der Konzentration des Proteins ausgewählt werden. Da die für FtsZ p gewählten Bedingungenolymerization entscheidend sind, ist es wichtig, den richtigen pH-Wert und KCl-Konzentration in den einzelnen Verfahren zu benutzen. In dieser Arbeit untersuchten wir 9 verschiedene Puffer mit einem pH im Bereich von 6,5 bis 7,5 und KCl-Konzentrationen von 0 M bis 300 mM. Wir haben festgestellt, dass die beste Voraussetzung, um FtsZs von B. analysieren subtilis und E. coli und ihre biologische Aktivität bei einem pH, die nahe physiologischer Ebene (7.5) zusammen mit einer hohen KCl-Konzentration. Bei einer hohen KCl-Konzentration hat FtsZ eine höhere GTPase-Aktivität und produziert Polymere, die besser durch Elektronenmikroskopie nachweisbar sind. Wir haben auch bestätigt, dass der physiologische pH-Wert und eine hohe KCl-Konzentration besser für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen FtsZ und regulatorische Proteine ​​als alle anderen Puffer verwendet werden, um hauptsächlich FtsZ Anordnung studieren. FtsZBs zeigt eine ähnliche Aktivität wie FtsZEc bei hohen KCl-Konzentration untersucht. Zusätzlich zu niedrigen Salzkonzentration der Einfluss des pH-Wertes ist besser sichtbar als in den Puffer mit hoher Salzkonzentration. FtsZ sometimes bei Verwendung von Puffer ohne KCl, fällt als Ergebnis sollte Puffer ohne Salz vermieden werden. Sedimentation von FtsZ Polymere ist niedrig, wenn unter Verwendung von Puffern mit hoher KCl-Konzentrationen. Dies kann ein Vorteil, wenn das Studium Wechselwirkungen zwischen FtsZ und Proteine, die FtsZ Filamente wie SepF und ZAPA montieren, da diese Strukturen höherer Ordnung sind einfach, mit Zentrifugation erkennen. In allen unseren Experimenten verwendeten wir MgCl 2 bei einer Konzentration von 10 mM. Es wurde gezeigt, dass ein relativ hoher Mg 2 +-Konzentration stabilisiert FtsZ Polymeren und verringert die GTPase-Aktivität von FtsZ. In Tabelle 2 sind Ergebnisse aus verschiedenen Studien zusammengefasst beschreiben FtsZ Polymerisation und GTPase-Aktivität bei unterschiedlichen Mg 2 +-Konzentrationen mit sonst gleichen Pufferbedingungen 27. Die gemessene Konzentration der freien zytoplasmatischen Mg 2 + ist 0,9 mm 3. Es sollte bemerkt werden, dass GTP wird eine äquivalente Menge von Mg 2 + chelatieren. Dos, die optimale Mg 2 +-Konzentration für GTPase Experimente rund 2-2,5 mM, die in der Nähe physiologischer Ebene 3 ist. Aber in unseren Experimenten verwendeten wir MgCl 2 bei einer Konzentration von 10 mM, eine leicht nachweisbare Lichtstreusignal zu erhalten und FtsZ Polymere während der Sedimentation Assay stabilisieren.

Obwohl wir unsere Protokolle angewendet FtsZ aus dem Modellorganismen E. coli und B. subtilis, können sie FtsZ von jedem anderen Organismus angepasst werden. Es ist zu beachten, dass die physiologischen pH-Wert und Konzentrationen von monovalenten und divalenten Kationen unterscheiden zwischen Organismen werden. Somit können die optimalen Bedingungen für FtsZ Polymerisation variieren. Unterschiede in der Verdopplungszeit und Wachstumsbedingungen von verschiedenen Bakterien können in verschiedenen Montage-Kinetik von FtsZ und optimalen Bedingungen der Experimente führen. Allerdings bietet unser Protokoll einen guten Ausgangspunkt für die Experimente mit FtsZs aus anderen Organismen. Die Protokolleist nützlich für die Untersuchung der FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder Untersuchungen über die Auswirkungen von kleinen Verbindungen und Arzneimittel auf FtsZ sein.

<td> ~ 30%
Quelle Polymerisation [% der FtsZ sedimentiert] GTPase [Pi / FtsZ / min] Mg 2 +-Konzentration [mM] FtsZ-Konzentration [um] Referenzen
FtsZ Ec ~ 28% ~ 2.1 10 12 Diese Arbeit
~ 50% ~ 2.4 10 12,5 27
~ 43% ~ 3,5 5 12,5 27
~ 27% ~ 4.6 2.5 12,5 27
ND ~ 5.4 2.5 5 26
FtsZ Bs ~ 0.8 12 Diese Arbeit
~ 52% (mit DEAE-Dextran) ~ 0,5 10 10 11
ND ~ 2,25 2.5 5 26

Tabelle 2. Auswirkungen auf Mg 2 + auf FtsZ Polymerisation und GTPase. Ergebnisse aus dieser Arbeit im Vergleich zu veröffentlichten Daten. Alle Versuche wurden in 50 mM MES / NaOH, pH = 6,5, 50 mM KCl durchgeführt wird.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit in unserem Labor wird von einem VIDI Zuschuss von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (zu DJS) finanziert. Wir danken Marc Stuart und der Abteilung für Elektronenmikroskopie an unserer Universität, für die Unterstützung bei und den Zugang zu dem Transmissionselektronenmikroskop.

Materials

GTP Roche 10106399001 Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes Beckman Coulter 343776 Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315 Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap Beckman Coulter 357448 Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL Raytest Isotopenmessgeräte GmbH 15000001 Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000 Fujifilm Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer Spectronic Instruments Part 5
Fluorescence Cell Hellma Analytics 105-250-15-40 Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial Electron Microscopy Sciences G400-Cu Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV Philips Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate BIOplastics B70501 Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit BioAssay System POMG-25H Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer BioTek Part 7

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References

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Król, E., Scheffers, D. FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations. J. Vis. Exp. (81), e50844, doi:10.3791/50844 (2013).
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