タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ
Summary
細胞変性効果（CPE）ベースのアッセイ、用量応答アッセイとTime-of-付加（TOA）アッセイを含む3つのアッセイは、同様に、開発され最適化され、検証され、ブルータングウイルスに対する新規な抗ウイルス（BTV）を識別するために利用されている新たに同定された抗ウイルス薬のための可能な作用機序（MOA）を決定するように。
Abstract
BTVに対する潜在的な抗ウイルス剤を同定するために、我々はここで紹介する3つのアッセイを開発し、最適化および検証されています。 CPEベースのアッセイは、化合物は、任意の抗ウイルス効果を示し、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用されているかどうかを評価するために開発された最初のアッセイであった。一方、抗ウイルス剤の細胞毒性はまた、CPEベースのアッセイを用いて評価することができる。用量応答アッセイは、 すなわち 、50％阻害濃度（IC 50）または有効濃度（EC 50）、ならびに細胞毒性のその範囲（CC 50）、選択された抗ウイルス効力のための範囲を決定するために設計された。のToAアッセイはBTVウイルスのライフサイクルやホスト細胞機構に影響の可能性の間に新たな抗ウイルス剤の基本的なメカニズムを決定するために、最初のMOAの研究のために使用した。これらのアッセイは、細胞培養系における抗ウイルス効果を評価するために不可欠であり、我々の最近の研究のために使用されているリードBTVに対する新規抗ウイルス薬の数の同定にING。
Introduction
BTV属オルビウイルス 、 レオウイルス科に試作品の二本鎖RNAウイルスである。 BTVは、世界中の1,230億ドル/年の損失と、ヒツジ、ヤギ、牛や他の家畜動物を含む家畜の中で最も重要な疾患の一つです。エキゾチックBTV血清型は、に記載されている重要な動物の病原体である「米国農務省ハイ帰結家畜病原体。 "最近では、再興BTVの北欧3,4間でいくつかの国で牛や羊の病気の大発生を引き起こした。その経済的重要性の結果として、モデル系として、BTVは、広範囲の分子遺伝学的および構造的研究の主題であった、いくつかのワクチンが開発されている。しかし、抗ウイルス薬の発見のための適切なアッセイがないために、BTVに対して利用可能な抗ウイルス薬は存在しない。
モデル系としてBTVを用いた最近のハイスループットスクリーニング（HTS）のキャンペーンでは、dは、eveloped最適化され、アルボウイルス5に対する潜在的な広域スペクトル抗ウイルス薬を識別するために、CPEベースのアッセイを検証しました。 CPEベースのアッセイは、迅速かつ観察可能なCPE /アポトーシスを誘導した5-7多数のウイルスに対する抗ウイルス薬物の発見に使用されている十分に認識アッセイである。我々のシステムでは、ポストBTV感染、CPEは、HeLa、BSRおよびHEK 293T 8を含む脊椎動物細胞において明らかである。 BTV誘発CPEを監視し、セルタイターグロ細胞生存度試薬キット（CTGキット）9を含む種々の細胞生存率検出法を用いて定量することができる。このキットは、代謝的に活性な生細胞の存在を示す細胞のATPの定量に基づいて培養物中の生存細胞の数を提示し、決定する。最適化された条件下で、ここに提示され、CPEベースのアッセイは、「ミックスと測定」1段階プロトコル、および安定した発光シグナルと柔軟性との実現可能性を示した。一方、毒性化合物REDUcing細胞生存率は、このCPEベースのアッセイで除外されます。 CPEベースのアッセイは、BTVに対する抗ウイルス薬の発見のためにその堅牢性と信頼性を示し、潜在的な抗ウイルス鉛化合物（Sの6小説クラスターの同定をもたらすNIH分子ライブラリ小分子リポジトリ（MLSMR）をスクリーニングするために使用されています）5。
潜在的な抗ウイルス化合物はCPEベースのアッセイを用いて同定された場合には、抗ウイルス効果および細胞毒性2の範囲を決定するために、10濃度の用量応答アッセイに供される必要がある。抗ウイルス効果は、50％阻害濃度（IC 50）又は50％有効濃度（EC 50）として表される、ベースラインと最大値の間のウイルス誘導CPEを半阻害する薬物の濃度である。抗ウイルス剤の細胞毒性は、50％細胞毒性濃度（CC 50）、 すなわち 、濃度ベースラインと最大値との間の細胞毒性の50％を誘導する薬剤である。 50％のSI（SI 50）と表記の選択指数（SI）は、ウイルス誘発CPEに対する抗ウイルスの特異性を決定する、CC 50 / IC 50から計算されます。 IC 50（またはEC 50）は 、CC 50およびSI 50値は、抗ウイルス化合物は強力な、さらなる薬物開発のために選択的であるかどうかを決定する重要な尺度である。
抗ウイルスがインビトロで明白な毒性を示さなかった、まだ防止ウイルスはCPE及び生産的なウイルスのライフサイクルを誘導した場合には、そのMOA 2を特徴付けることが重要である。我々は、抗ウイルスによって影響されるウイルスのライフサイクルの可能な工程（単数または複数）を決定するためのToAアッセイを行うことにより、このような特徴付けを開始した。一般に、抗ウイルス化合物を、異なる時間前又は後のウイルス感染で細胞に添加した。抗ウイルスが感染した細胞に添加した場合のその標的へ投稿前のステップに添加されたものと比較した場合、TEPは、感染の過程で、より低い活性をもたらすであろう。したがって東亜の研究では、いずれかのウイルスのライフサイクルまたはウイルスのライフサイクルに関与するホスト機器に、化合物の抗ウイルス効果、およびその潜在的なターゲットを決定するために重要である。
3つ全てのアッセイについて、細胞生存率を、製造業者の指示5以下CTGキットを用いて決定した。この検出システムは、様々なインハウスソフトウェアを使用して分析することができる適切な発光信号を出力する。各アッセイは、少なくとも8レプリカを三重に検証され、実施された。すべての得られたデータについては、平均値（AVE）、標準偏差（STDEV）、および共効率的変動（CV）を含む三のパラメータは、アッセイのロバスト性を決定するために分析した。アッセイのロバスト性が決定されると、データは、さらに分析し、種々の生物静力学およびGRAPHIを用いてプロットされCツール2。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗ウイルスヒットの最初の同定については、抗ウイルス薬の発見および開発のための重要なステップの一つは、定量化可能なマーカーを選択する簡単なプロトコルを開発し、十分な信号及び10％未満のCVを求める含む、堅牢なアッセイを開発することである。ほとんどの生化学的または細胞ベースのスクリーニングは、スクリーニングプロセスで必要な再現性及びスクリーニングされる分子の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、NIHからQ.李に、衝撃ファンドによるUABの医学部からQ.李への助成金1R03MH08127-01と7R03MH08127-02でサポートされていました。 Molette基金とオーバーン大学からのサポートが認識されている。また、作業の過程で氏PULINチェ氏と国立歌Musiienkoから技術の処遇に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
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