فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق
Summary
وقد وضعت ثلاثة فحوصات، بما في ذلك تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) القائم على الفحص، فحص الجرعة والاستجابة والوقت من بين الجمع (قسم) مقايسة، إلى أقصى حد، والتحقق من صحة استخدامها لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق رواية (BTV)، فضلا لتحديد آلية ممكنة من بين العمل (وزارة الزراعة) لمضادات الفيروسات التي تم تشخيصها حديثا.
Abstract
لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات محتملة ضد BTV، وضعنا، والتحقق من صحتها ثلاثة الأمثل المقايسات المقدمة هنا. وكان الفحص القائم على CPE الفحص الأولى وضعت لتقييم ما إذا كان مركب أظهر أي فعالية المضادة للفيروسات والتي استخدمت لفحص مكتبة مجمع كبير. وفي الوقت نفسه، ويمكن أيضا أن يتم تقييم السمسة من الأدوية المضادة للفيروسات باستخدام مقايسة على أساس CPE. وقد تم تصميم مقايسة بين الجرعة والاستجابة لتحديد نطاق فعالية للفيروسات المحدد، أي 50٪ تركيز المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال (EC 50)، فضلا عن مجموعة من السمية الخلوية (CC 50). كان يعمل مقايسة قسم لدراسة وزارة الزراعة الأولية لتحديد الآلية الأساسية من الأدوية المضادة للفيروسات الرواية خلال دورة حياة BTV الفيروسية أو تأثير ممكن على المضيف الآلات الخلوية. هذه المقايسات الحيوية لتقييم فعالية المضادة للفيروسات في نظام الثقافة الخلية، واستخدمت لأبحاثنا الأخيرة تؤديجي إلى تحديد عدد من الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV.
Introduction
BTV هو النموذج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي للفيروس في جنس الفيروسة الوقبية، والأسرة Reoviridae. BTV هي واحدة من أهم الأمراض من الماشية المحلية، بما في ذلك الأغنام والماعز والأبقار والحيوانات الأليفة الأخرى، مع 3000000000 $ / سنوات الضياع في جميع أنحاء العالم 1،2. وBTV المصلي الغريبة هو الممرض الحيوانية الهامة المدرجة في "وزارة الزراعة الأميركية العليا العواقب الثروة الحيوانية مسببات الأمراض." في الآونة الأخيرة، وإعادة الظهور BTV وقد تسبب انتشار واسع للمرض في الماشية والأغنام في العديد من البلدان في جميع أنحاء شمال أوروبا 3،4. نتيجة للأهمية الاقتصادية وكنظام نموذج، كان BTV موضوع الدراسات الجزيئية والجينية وهيكلية واسعة النطاق كما تم تطوير العديد من اللقاحات. ولكن نظرا لعدم وجود فحوصات المناسبة لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات، لا توجد الأدوية المضادة للفيروسات المتاحة ضد BTV.
في الآونة الأخيرة إنتاجية عالية الفرز (HTS) الحملة باستخدام BTV كما في النظام النموذجي، ونحن دeveloped، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها مقايسة على أساس CPE لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف محتملة ضد arboviruses 5. مقايسة على أساس CPE هو فحص معترف بها التي استخدمت في اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد عدد من الفيروسات التي يسببها السريع ويمكن ملاحظتها CPE / موت الخلايا المبرمج 5-7. في نظامنا، بعد الإصابة BTV، CPE هو واضح في خلايا الفقاريات، بما في ذلك هيلا، BSR، وكلوة الجنين البشري 293T 8. ويمكن رصد CPE BTV التي يسببها وكميا باستخدام مختلف أساليب الكشف عن خلية الجدوى، بما في ذلك CellTiter جلو عدة بقاء الخلية كاشف (CTG عدة) 9. يحدد هذه المجموعة عدد من خلايا قابلة للحياة في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة، وهو ما يشير إلى وجود الخلايا الحية عملية الأيض نشطة. في ظل الظروف الأمثل، القائم على الفحص CPE المقدمة هنا أظهر جدواه مع "مزيج وقياس" البروتوكول خطوة واحدة، والمرونة مع إشارات الانارة مستقرة. وفي الوقت نفسه، المركبات السامة reduالوراثة بقاء الخلية سيتم استبعاد في هذا الاختبار القائم على CPE. وأظهر الفحص القائم على CPE متانة وموثوقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد BTV، واستخدمت لفحص NIH المكتبات الجزيئية الصغيرة جزيء مستودع (MLSMR)، الأمر الذي يؤدي إلى تحديد ستة العنقودية رواية المحتملة المضادة للفيروسات مركب الرصاص (ق ) 5.
عندما تم التعرف على مركب مضاد للفيروسات المحتملة باستخدام مقايسة على أساس CPE، وسوف تحتاج إلى أن تخضع لعشرة تركيز الجرعة والاستجابة فحص لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات والسمسة 2. فعالية المضادة للفيروسات، ممثلة على النحو تركيز 50٪ المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال 50٪ (EC 50)، هو تركيز للدواء الذي يثبط التي يسببها فيروس CPE في منتصف الطريق بين خط الأساس والحد الأقصى. السمسة الأدوية المضادة للفيروسات، أي تركيز السمسة 50٪ (CC 50)، هو تركيزمن المخدرات حمل 50٪ من السمسة بين خط الأساس والحد الأقصى. ويتم احتساب المؤشر انتقائية (SI)، كما تدل 50٪ SI (SI 50) من CC 50/50 IC الذي يحدد خصوصية المضادة للفيروسات ضد CPE التي يسببها الفيروس. وIC 50 (أو EC 50)، CC 50 و 50 SI القيم هي تدابير حاسمة لتحديد ما إذا كان مركب مضاد للفيروسات هو قوية وانتقائية لمزيد من التطوير المخدرات.
عندما أظهرت المضادة للفيروسات لا سمية العلني في المختبر، ولكن الفيروس منعت يسببها CPE والفيروسية دورة الحياة الإنتاجية، فمن المهم لتوصيف وزارة الزراعة 2 منها. بدأنا هذا التوصيف من خلال تنفيذ قسم فحص لتحديد الخطوات الممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي يتأثر المضادة للفيروسات. عموما، أضيفت مجمع المضادة للفيروسات إلى الخلايا في أوقات مختلفة قبل أو عدوى فيروس آخر. إذا أضيفت مضادات الفيروسات إلى الخلايا المصابة إضافة إلى المستهدف قTEP أثناء الإصابة، فإنه من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بالمقارنة مع واحد والتي تم إضافتها قبل الخطوة. وبالتالي، دراسة قسم هو أمر حاسم لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات من مركب، والهدف إمكاناته، إما على دورة الحياة الفيروسية أو آلات المضيفة المشاركة في دورة الحياة الفيروسية.
لجميع المقايسات الثلاثة، تم تحديد بقاء الخلية باستخدام عدة CTG التالية تعليمات الشركة الصانعة 5. هذا النظام بإخراج الإشارات الكشف التلألؤ الكافية التي يمكن تحليلها باستخدام برامج مختلفة في المنزل. تم التحقق من صحة كل فحص، وأجرى على الأقل في ثلاث نسخ مع ثمانية النسخ المتماثلة. لجميع البيانات التي تم الحصول عليها، تم تحليل ثلاثة معايير، بما في ذلك القيمة المتوسطة (AVE) والانحراف المعياري (STDEV)، وشارك في كفاءة الاختلاف (CV) لتحديد متانة مقايسة. مرة واحدة وقد تم تحديد متانة الفحص، سيتم زيادة تحليل البيانات ورسم باستخدام مختلف الاستاتيكا البيولوجية والجرافيكأدوات ج 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحديد الأولي من الزيارات المضادة للفيروسات، واحدة من الخطوات الرئيسية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات والتنمية هو وضع المقايسات قوية، والذي يتضمن اختيار علامة للقياس الكمي، ووضع بروتوكول بسيطة، والحصول على إشارات كافية وأقل من 10٪ السيرة الذاتية. وقد صممت معظم …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا المشروع من خلال منحة 1R03MH08127-01-02 و7R03MH08127 من المعاهد الوطنية للصحة لQ. لي، والأموال IMPACT من قسم الطب في البنك العربي المتحد إلى Q. لى. هو محل تقدير الدعم من صندوق Molette وجامعة أوبورن. نحن نشكر أيضا المساعدات الفنية من السيدة Pulin تشي والسيد فولوديمير Musiienko أثناء العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
