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Environment

Technik zur Untersuchung Gliederfüßer und Mikrobielle Gemeinschaften im Baum Tissues

Published: November 16, 2014
doi:
10.3791/50793
, , , ,
1School of Forestry,Northern Arizona University, 2Acoustic Ecology Institute

Summary

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Abstract

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

Introduction

Phloem und Rinde Geweben von Nadelbäumen sind Gastgeber für Tausende von Organismen. Phloeophagy, die Fütterung auf Phloem Gewebe der inneren Rinde, ist eine Gewohnheit der Regel mit Borkenkäfern, woodborers und mehrere andere wirbellose und mikrobielle Taxa, die in Bäumen leben assoziiert 23 Borkenkäfer. (Coleoptera: Curculionidae) entwickeln und leben innerhalb Phloem Ausnahme kurze Zeiträume, wenn Erwachsene suchen neue Wirtsbäume. 31 Borkenkäfer wurden ausgiebig durch ihre wirtschaftlichen Auswirkungen auf Bäumen 18,19 studiert, aber direkte Verhaltensbeobachtungen der Insekten innerhalb Baum Materialien begrenzt. 4 Darüber hinaus sind die Galerien von Borkenkäfern konstruiert werden Lebensraum für eine Vielzahl von Arten. 11 in unüberschaubarer Menge Pilze 30, Bakterien 3, Milben 10,21, und Nematoden 16,19 zusammen mit anderen räuberischen und parasitären Arthropoden 22,24 bewohnen das Phloem Material. Die hier zur Verfügung gestellten Technikenermöglichen die direkte Beobachtung von Borkenkäfern, Milben und Holzbohrer, die typischerweise leben in subkortikalen Umgebungen. Geringe Änderungen des Protokolls können, um Pilze und Bakterien zu untersuchen.

Borkenkäfer und zugehörigen Organismen im Baum Geweben wurden mit einem Studium "Phloem Sandwich." Early Einsatz dieser Technik kann in der Literatur aus dem Jahr 1933, als es verwendet wurde, um die Larvenstadien der Douglasie Käfer beobachten (gefunden werden Dendroctonus pseudotsugae). 2 Das Phloem Sandwich hat viele Ableitungen wie verschiedene Materialien zur Verfügung standen gegangen. Ursprünglich bestand aus einem Stück Phloem zwischen zwei Glasplatten, die durch elastische Bänder zusammengepresst dieses Gerät. 2 Später haben Klammern, Klebeband, Klebstoff, Kunststoff und anderen Materialien in der Konstruktion der Sandwich verwendet. 13,14 , 15,17,26,28 Das hier beschriebene Protokoll bietet Verbesserungen gegenüber einigen der letzten Designs. Zum Beispiel inder Vergangenheit wurden Testspezies in die Seite des Sandwich zwischen den Platten aus Glas oder Kunststoff eingegeben. Dies beschränkt den Bau von Galerien in eine Richtung. Die Verwendung von Eintrittslöcher in der oberen Platte ermöglicht eine größere Freiheit für die Testspezies auf natürliche Stollen- initiieren. Ein weiterer Vorteil des vorgestellten Protokolls ist dessen vereinfachte Konstruktion, die leicht mit wenigen Werkzeugen ausgebildet sein kann. Die Verwendung des Phloem Sandwich hat für den direkten Beobachtungen der Fressverhalten, Fortpflanzung, Entwicklung erlaubt, und Interaktionen von Organismen, die sonst nicht möglich gewesen wäre. 1,5, 22 Diese Methode ist auch ein ausgezeichnetes Werkzeug für K-12 Bildung und Wissenschaft Programme und Displays.

Es gibt mehrere Feinheiten in der Schaffung eines Phloem Sandwich, das schwer von interpretieren oder nicht in Handschriften ausgewiesen. Wir glauben, daß eine visuelle (dh Video) Beschreibung der Herstellung eines Sandwich Phloem erforderlich und würdenvon Wert für Wissenschaftler und Pädagogen Interesse an einem Studium phloeophagous Organismen. Unser Protokoll bietet eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um Arthropoden, Mikroben und anderen Organismen, die Phloem-Gewebe besiedeln beobachten.

Protocol

1. Phloem Auswahl und Streichung Baum Wählen Sie einen Baum mit besonderen Eigenschaften. Sammeln Phloem von Kiefern (dh Bäume in der Gattung Pinus), da sie einen unverwechselbaren Phloem Schicht, die mehrere Millimeter dick ist. 18,27 Sobald ein Baum befindet, die nur wenige unteren Äste hat, kontrollieren Sie sie für sonstige Mängel, wie Insektenangriffe haben und / oder Krankheitserregern. Alternativ können Sie Phloem von anderen Nadelbäumen wie Fichten im Phloem Sandwiches. 9 Sonstige Baumarten können für Phloem Entfernung sein, wie Laubhölzer. HINWEIS: Nadelbäume mit großen Kronen haben typischerweise die dickste Phloemgewebe. Um die Menge des Phloem zu maximieren, ist es am besten, Bäume, die wenigen Defekten und Äste am Stamm (Bole) haben geschnitten. Kiefernarten, die Selbstschnittarbeiten sind am besten. Phloem ist typischerweise dicksten während der Vegetationsperiode und ist dicker höher Kofferraum als in Bodennähe. Phloem ist manchmal schwierig, Remove von den Bäumen in den Herbst oder Winter Jahreszeiten. Schneiden Sie ein Baum um oder nutzen kurzem geschnitten Protokolle Phloemgewebe erhalten. Wählen Sie eine Fallrichtung, die Schäden an der Baum sowie in der Nähe Bäume minimieren. Cut zweigt den Kofferraum, um einen leichteren Zugang zu bellen Materialien während Phloem Entfernung zu ermöglichen. Sobald ein Baum gefällt (gefällt; auf den Boden fallen gelassen) beginnen Abschaben der Rinde des Stammes mit einem scharfen Ziehklinge (Abb. 1A). Schaben einen Bereich der Rinde bis das Phloem Schicht erreicht ist. HINWEIS: Das Phloem Schicht ist typischerweise in der Farbe heller (zB cremefarben) und feucht, während die äußere Rinde ist trockener und dunkler in der Farbe (Abb. 1b). Besondere Vorsicht nicht, das Phloem kratzen. Die Fläche der Rinde abgeschabt, hängt von der Größe des Phloem Stück (s) erforderlich. Nachdem die Rinde entfernt wird, schneiden einen Umriss des Phloem Stück mit einem scharfen Messer. Sicherstellen, dass das Messer schneidet den ganzen Weg zu dem Xylem (Fig. 2A). Um das Phloem zu entfernen, starten Sie an einer Ecke des Phloem Stück mit den Fingern vorsichtig schälen die Phloem. Mit einem Messer in Abkratzen der Phloem aus dem Xylem unterstützen. Weiterhin das Ziehen des Phloem ab, bis das gesamte Stück entfernt wird. HINWEIS: Phloem schält typischerweise off des Baumes am einfachsten im Sommer. Für die Phloem außerordentlich schwierig zu entfernen ist, kann ein spachtelförmiges Werkzeug in der Anstrengung zu unterstützen. Legen Sie das Phloem Stück sofort in einen sterilen Beutel. Für beste Ergebnisse, Vakuum den Beutel (Abb. 2B) bzw. bei Verwendung ziploc Taschen, entfernen Sie alle Luft aus dem Beutel. Dies erhöht die Lebensdauer des Phloem. Optional legen mehrere Stücke von Phloem in einem Beutel. Shop Phloem in luftdichten Beuteln leicht über dem Gefrierpunkt (zwischen 1 und 10C), um seine Frische behalten. 2. Erstellen der Phloem Sandwich Schneiden Sie zwei gleich große Stücke aus klarem Acryl, Polycarbonat oder einem ähnlichen harten, klaren Material (zB Glas) etwas größer ausr als das Stück Phloem (Abb. 2C). Rund um die Kanten der Acryl um die Ecken reißt die Parafilm Dichtung zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet einen 1/8 in. Dicken Plexiglas. HINWEIS: Die Größe der geschnittenen Stücke hängt von den Bedürfnissen des Subjekts Organismus und der Dauer der Studie. Zum Beispiel ein Paar von Borkenkäfern nutzt 4 dm 2 Phloem über einen Monatszeitraum, aber brauchen nur 1 dm 2, wenn die Studie innerhalb von mehreren Tagen stattfindet. Bohren Sie ein Loch in eine der Acrylstücke um den Eintritt von Studienorganismus (en) zu ermöglichen. Die Größe und Anzahl der Löcher hängt von den Zielen (Fig. 2D). Vor Inbetriebnahme des Phloem zwischen den Acrylstücke, sterilisieren Acryloberfläche (mit> 70% Ethanol) oder, bei Verwendung von neuen Acryl, die Schutzfolie entfernen. Legen Sie das frische Stück Phloem zwischen den sterilen Acryl Stück. Orient das Acrylstück mit der Bohrung (en) auf der Innen- oder Außenseite des Phloem whichever erforderlich ist. Typischerweise stehen die Aussenseite des Phloem (Seite, die Rinde hatte) in Richtung auf die Eintrittsöffnungen. 3. Dicht Phloem Sandwich Um eine temporäre Dichtung um das Phloem Sandwich zu erstellen, verwenden 2 in. Breit an den Rändern des Phloem Sandwich (Abb. 2C) zog Parafilm-Streifen. Alternativ können Sie eine Polyvinylidenchlorid Wrap, um die Kanten zu versiegeln. 6 Als nächstes legen Sie eine Klammer auf jeder Seite des Sandwich um die Acryl zum Phloem quetschen. Sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche nach unten geklemmt, um Luftzwischenraum zwischen der Acryl- und Phloem (2C) zu verhindern. Wenn sie nicht richtig eingespannt ist, können die Proben zwischen der Acryl- und Phloem einziehen. So erstellen Sie eine semi-permanente Abdichtung fügen Sie einen nicht-Kleben Epoxy oder Vaseline um den Phloem. Stellen Sie sicher, dass das Material die Phloem vollständig umgibt. Als Nächstes verwenden Sie Klammern oder Schrauben mit Schrauben (müssen möglicherweise Bohrungen vor der Zeit zu bohren), um die Acryldicht Phloem halten.Die Sandwiches nur lebensfähig bleiben für bis zu ein oder zwei Monate. In Abhängigkeit von den Sauerstoffbedarf der Studie Organismen, fügen einen Luftfilter auf eine oder mehrere Seiten des Sandwich. Dies wird ermöglichen, dass Luft in das Phloem Sandwich geben aber den Wasserverlust aus dem Phloem begrenzen. Wir verwenden einfache Aktivkohlefilter, die auch die Gefahr von pilzlichen und bakteriellen Kontamination zu reduzieren. Für Studien Exemplare, die Ein- und Ausreise an benötigen, ersetzen Sie eine der Acrylstücke mit Holz oder ähnliches Material, die ein Insekt in die Bohrung kann. Dies ist besonders wichtig für die Beobachtung der Holzbohrer, da nach ihrer Larvenzustand im Phloem Schicht abgeschlossen ist, sie dann die Bohrung in das Xylem. Um Probanden aus Verlassen der Eingangslöcher zu vermeiden, legen kleine Petrischalen (oder andere Objekte, Band) über die Löcher, Sperrung Flucht. Da Organismen, die in diesen Räumen befinden sich daran gewöhnen, schlechten Lichtverhältnissen kann es erforderlich sein, die Sandwiches in einem dunklen Raum oder Kasten, oder Ort o platzierenpaque Material oben, um das Licht zu blockieren. 4. Observing Organismen im Phloem Sandwich Einzuführen Studie Proben in Öffnung des Phloem Sandwich (Abb. 2D). Beachten Proben mit einem Binokular unter einer roten Ampel oder weißes Licht auf eine geringe Lautstärke (Abb. 2E) gesetzt. Um die Aktivitäten oder das Wachstum von Exemplaren innerhalb der Phloem Sandwich aufzeichnen befestigen eine Kamera oder Videokamera an das Mikroskop. Bringen spezielle Videokameras, um das Okular des Mikroskops (Abb. 2E & F). Für sehr kleine Organismen wie Milben, Nematoden, und Pseudoskorpione, verwenden Sie ein High-Definition-Videokamera an das Mikroskop angeschlossen. Um Geräusche aufzeichnen, legen Sie Mikrofone in die Eintrittsloch des Phloem Sandwich oder durch die Seite des Phloem Sandwich. Da das Eintrittsloch ist klein, mit einem kleinen Mikrofon wie ein Elektret-Kondensatormikrofon. Von der Seite oder Oberfläche aufzeichnendas Phloem Sandwich mit einem Piezoelement (Abb. 3B). Um Ton wiederzugeben, verwenden Sie den gleichen Piezoelement oder fügen Sie eine taktile Wandler (Erreger) an die Oberfläche der oberen oder unteren Rand des Acryl.

Representative Results

Das oben beschriebene Protokoll wird ein Forscher ermöglichen, Organismen, die in der kryptischen Umgebung unterhalb der Rinde eines Baumes leben beobachten. Um die Verwendung dieser Technik beschreiben wir eine repräsentative Studie aus unserem Labor, die diese Technik. 12 In diesem Experiment verwendet zu erläutern, wurden Phloem Sandwiches verwendet, um die Auswirkungen von akustischen Behandlungen auf Reproduktionsleistung, Tunnelabstand, und das Überleben der Borkenkäfer beobachten (Abb . 2E und 2F). Die direkte Beobachtung von Käfern, die durch die Verwendung eines Phloem Sandwich möglich, ergab einige interessante Erkenntnisse. Zuerst nahmen wir täglich Tunnelstrecken durch Markieren der Käfer 'Standort auf dem Acryl mit einem Marker alle 24 Stunden. Dieser Prozess ergab signifikante Unterschiede zwischen den Sound-Behandlungen, die ohne Phloem Sandwich versteckt worden wäre. Weiter konnten wir eine Reduktion der Eierproduktion mit besonderer Klangbehandlungen. Die mobile Art des Phloem Sandwich für e erlaubtgg Beobachtungen unter einem Binokular ohne die Käfer stören abgeschlossen sein. Während dieser Beobachtungen erfasst wir Käfer Eiablageverhalten mit einem High-Definition-Kamera an das Mikroskop angeschlossen. Andere bemerkenswerte Beobachtungen enthalten die Tötung von Kameraden und die Einleitung Flug mit bestimmten akustischen Behandlungen verbunden. Das Phloem Sandwich-Assay war entscheidend für unser Studium der Borkenkäfer Reaktionen auf akustische Behandlungen. Diese Entdeckungen, die nicht möglich sein, unter der Rinde eines Baumes zu beobachten wäre, sind wertvolle Beiträge zur Entwicklung von Management-Optionen zur Bekämpfung von Borkenkäfer-Ausbrüche. Abbildung 1. A) Werkzeuge benötigt, um Rinde von Baum zu entfernen. Artikel 1 und 2 sind zur Rinde des Baumes kratzen Unentschieden Klingen. Artikel 3 (Beil) und 4 (Zugsäge) sind nützlich, um Zweige zu entfernenin der Nähe von Scherbereich. B) Verwendung der Ziehklinge, um Rinde von Baum zu entfernen. Beachten Sie die Lichtfarbe der Phloem unter der rötlichen Rinde. Abbildung 2. A) Entfernung von Phloem nach Rinde wurde der Baum. B) Frische Phloem im Vakuum versiegelten Beutel. C) Phloem Sandwich mit Klemmen Zusammenhalten der Acrylteile und Parafilm um Kanten, um eine Kontamination und Austrocknung der Phloem verhindern gespeichert abgeschabt. D ) Borkenkäfer nahe Loch in Acryl. E gebohrt) Mit Mikroskop, um Phloem Sandwich beobachten. F) Video-Anzeige von Borkenkäfern im Phloem Sandwich. Figur 3. <strong> A) Pheromone Erwerb von Käfern in Phloem Sandwich. Luft durch Röhrchen, die Super Q saugfähig. B) Aufnahme und Wiedergabe von Ton über einen piezoelektrischen Wandler (Bildmitte), um Latschenkiefer Käfer im Phloem Sandwich gezogen.

Discussion

Das Phloem Sandwich ermöglicht die Einführung und Beobachtung von Arthropoden, Mikroben und andere kleine Organismen, die Phloem Gewebe bewohnen. 1,7,8,9,17,18 Diese Technik hat sich in neuen Entdeckungen geführt und ein besseres Verständnis der Verhaltensweisen, Lebens history traits, Entwicklung und Wechselwirkungen der Organismen im Baum Phloem. 1,5,10 Das Sandwich hier beschriebene Protokoll ist ein Hybrid aus Vergangenheit entwirft, und eine wirtschaftliche Sandwich, das leicht mit minimaler Ausrüstung und Materialien aufgebaut ist bereitzustellen. Die Glas, Acryl oder Polycarbonat Stücke können wiederverwendet werden, und die einzigen Verbrauchsmaterialien sind die Parafilm und Phloem.

Obwohl alle Schritte in dem Protokoll sind wichtig, sollten bestimmte Schritte streng einzuhalten, um den höchsten Grad an Erfolg zu gewährleisten. Zunächst wird ein Baum befinden sollte, dass ein Teil der Baumstämme frei oder relativ frei von Zweigniederlassungen hat. Bäume, die viele Filialen haben, sind schwer zu rasieren und werde yield wenige lebensfähige Phloem Stücke, wie jeder Zweig muss um beim Entfernen der Phloem geschnitten werden. Weiter ist es wichtig, die Luftexposition des Phloem minimieren. Wir legen schnell jedes Phloem Stück in einem Beutel bei Entfernung. Nachdem drei Minuten vor sechs Stücke entfernt werden, werden sie in einer vakuumversiegelten Beutels übertragen werden; verwenden wir ein Wechselrichter, um die Versiegelung aus einer Fahrzeugbatterie im Bereich laufen. Zuletzt, Desinfektion der Acrylteile und allgemeine Sauberkeit bei der Ausführung dieses Protokoll wird das Pilzwachstum in der Sandwich reduzieren. Dies ist besonders wichtig für längere Beobachtungen.

Wie oben erwähnt, gibt es Einschränkungen der Phloem Sandwichvorrichtung. Da das Phloem Schicht dünn ist, kann nur kleine Organismen, die in der Regel im Phloem bleiben in die Sandwich eingeführt werden. Größere Insekten wie Holzbohrer (dh Buprestid, Cerambycid Arten) eingeführt und für die frühen Stadien ihres Lebenszyklus beobachtet werden. Dieser Zeitrahmen ist in der Regel auf zwei beschränkt3 Wochen; nach diesem Punkt die Larven benötigen Xylem Holz zu bohren in für Verpuppung. Im Gegensatz dazu für Borkenkäfer, vor allem jene aus der Gattung Ips, kann eine vollständige Lebenszyklus beobachtet einschließlich werden Paarung, Ei schlüpft, Fütterung, Verpuppung und Schlüpfen in einen Erwachsenen Käfer. An diesem Punkt wird die Lebensfähigkeit des Sandwich in der Regel aufgrund Austrocknung und Pilzwachstum erschöpft. 28 Darüber hinaus bietet diese Vorrichtung nicht erlauben Insekten frei und natürlich zu besiedeln oder Verlassen des Phloem Sandwich. 27

Unser Protokoll ist flexibel in Bezug auf Größe, Form und Art der Phloem verwendet. Kurzstudien erfordern weniger Phloem Material und Sandwichgröße kann entsprechend skaliert werden. Viele Nadelbaumarten wurden als Phloem Spendern in einem Phloem Sandwich verwendet worden (zB Ponderosa-Kiefer 12, Douglasie 2, Fichte 29, Taedaföhre 27. longleaf Kiefer 27). Materialien im Sandwich kann auch verändert werden; für die Exweise Glasplatten können anstelle von Acryl- und Epoxidharze oder Band statt Parafilm verwendet werden.

Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist das Phloem Entfernungsprozess. Bäume nebeneinander kann in, wie schwierig die Phloem zu entfernen abweichen. Wenn ein Baum hat schwer Phloem, Geduld ist kritisch. In diesen Fällen sorgfältig ausführen ein Messer zwischen dem harten Xylem und dem schwammigen Phloem. Dieser Prozess fühlt sich buchstäblich wie Skinning der Baum.

Nach Beherrschung der Grund Sandwich-Technik, können Änderungen an dem Protokoll fit spezifischen Bedarf zu helfen. Beispielsweise durch Honen der Techniken erforderlich, um Phloem zu entfernen, können größere Stücke entfernt und verwendet werden, um größere Sandwiches erzeugen. Auch können Änderungen vorgenommen, um spezifische Instrumente, wie zB zusätzliche Bohrungen zu überwachen chemische Emissionen (Abb. 3A), oder Aufnahme oder Wiedergabe Sounds (Abb. 3B) unterzubringen. Modifikationen können vorgenommen werden, um semi-permanenten Erhaltung Phloem und ihre Organ ermöglichenIsmen oder für temporäre Beobachtungen von Organismen, die später freigelassen werden kann.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Eli Jensen, Stefano Padilla, and Kasey Yturralde for assistance, and Karen London and anonymous reviewers of the manuscript. We thank Jake Baker and Karla Torres for video footage. Funding was provided to R.W.H by the NAU School of Forestry and NAU Technology and Research Initiative Fund (TRIF).

Materials

Draw blade Big Horn Brand  20265 11” blade
Fillet Knife American Angler 30530 9” blade
Polycarbonate Nexan GE-33 0.093 in. thickness
Parafilm M Fisher Scientific S37441 2” wide
Clamps Pony Jaw Opening 3201-HT-K 4” x 1”
Vacuum Sealer  FoodSaver V2840,  VacLoc vacuum 
and bags FSFSBF0742-015 bags in rolls
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References

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