Protocolli per l'implementazione di un<em> Escherichia coli</em> Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

1. Estratto cellulare Crude Preparazione Preparazione estratto cellulare greggio nell'arco di tre giorni richiede due persone a condurre in modo efficiente. Il protocollo è composto funzionalmente da tre parti: la crescita della cultura (passo 1.1 al passo 1.11), lisi cellulare (punto 1.12 al punto 1.37), ed estrarre chiarificazione (passo 1.38 a passo 1.52). Si presenta diviso in giorni per convenienza. Estratto ideale può produrre 0,75 mg / ml di deGFP dal plasmide pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), ed ha una concentrazione di estratto cellulare grezzo tra 27-30 mg / ml di proteina. 4 Tuttavia , caratteristiche estratto variano da lotto a lotto. La ricetta che segue fornisce sufficiente per circa 3.000 reazioni singole (6 ml di estratto di cellule greggio). Se ridimensionamento, si consiglia di utilizzare non meno di 1/6 dei valori qui indicati. A causa di vincoli di tempo, scaling up non è raccomandato. Giorno 1 Preparare terreni di coltura batterica, culpiastra tura, e dei media integratori come descritto nella tabella 1. Vedi supplementare Materiale 1 per le ricette. . Consecutive BL21-Rosetta2 ceppo da -80 ° C su una piastra di agar 2xYT + P + Cm e incubare per almeno 15 ore a 37 ° C o fino colonie sono facilmente visibili Nota: Cloramfenicolo (Cm) viene usato per selezionare un plasmide codifica tRNA rare nel ceppo BL21-Rosetta2. Day 2 Preparare buffer e supplementi come descritto nella Tabella 2. Vedi supplementare Materiale 1 per le ricette. Preparare e sterilizzare materiali necessari per il giorno 3, tra cui: 6 x 4 palloni L Erlenmeyer con la copertura di alluminio (autoclave), 4 x 1 L bottiglie centrifuga sterili, imbuto (autoclave), 100 g di 0,1 mm perle di vetro (autoclave), 2 mescolare-bar (autoclave), 1 L e 500 ml cilindro graduato (autoclave), 2 x 1 L bicchieri (autoclave), 3 ml siringa con 18 aghi sterili (G), 2-3 flboe avena, 2-3 10k MWCO cassette di dialisi (sterile), cuvette. Preparare mini-cultura 1. Aggiungere 4 ml di 2xYT + P media e 4 ml di Cm per un 12 ml sterile provetta di coltura e pre-riscaldare a 37 ° C per 30 min. Seminare mini-cultura 1 con una colonia dal + P + piastra Cm agar 2xYT. Incubare a 220 rpm, 37 ° C per 8 ore. 7 ore e 30 minuti più tardi, preparare mini-cultura 2. Aggiungere 50 ml di 2xYT + P media e 50 ml di Cm in un pallone sterile da 250 ml e pre-riscaldare a 37 ° C per 30 min. Seminare mini-cultura 2 con 100 ml di mini-cultura 1 e incubare a 220 rpm, 37 ° C per 8 ore. Day 3 Pesare quattro sterili da 50 ml provette Falcon vuoti e di massa record nella tabella 3. Raffreddare provette Falcon su ghiaccio, che saranno successivamente utilizzati nella fase 1.18. 7 ore e 30 minuti dopo la fase 1.8, preparano finale terreni di coltura batterica. Usando una sterile 1 L cilindro graduato, trasferimento 660 ml di 2xYT + P supporti into ognuno dei sei 4 palloni L Erlenmeyer e pre-riscaldare a 37 ° C per 30 min. Nota: 4 L o superiore beute sono consigliati per una corretta aerazione. Aggiungere 6,6 ml di mini-cultura 2 in ciascuna beuta 4 L. Incubare a 220 rpm, 37 ° C fino a quando la coltura raggiunge un diametro di 1,5-2,0 a 600 nm (corrispondente alla fase di crescita medio-log). Verificare OD periodicamente con una diluizione 1:10 cultura per la precisione Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di 3 ore – 3 ore 45 min;. Rapida crescita e la raccolta durante la fase di mid-log è fondamentale per la qualità dell'estratto. Subito dopo la crescita, trasferire tutte le culture uniformemente in quattro bottiglie da centrifuga 1 L e centrifugare a 5000 xg per 12 min a 4 ° C per sedimentare le cellule batteriche. Mentre centrifugazione, completa preparazione tampone S30A aggiungendo 4 ml di 1 M DTT a 2 L di S30A precedentemente preparato. Mescolare e mantenere tampone sul ghiaccio. Quando centrifugazione, rimuovere completamente il surnatante dal punto 1.12 da decanting e tamponando le bottiglie centrifuga su un tovagliolo di carta sterile. Aggiungere 200 ml di tampone S30A a 4 ° C per ciascuno dei quattro bottiglie da centrifuga, e agitare le bottiglie vigorosamente fino a pellet è completamente solubilizzato senza rimanenti grumi. Centrifugare le quattro bottiglie a 5.000 g per 12 min a 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante dal passo precedente decantando e tamponando le bottiglie centrifuga su un tovagliolo di carta sterile. Ripetere i punti 1.15 e 1.16. Aggiungere 40 ml di tampone S30A a 4 ° C per ogni bottiglia centrifuga. . Trasferire ciascun pellet e la combinazione S30A in un tubo Falcon refrigerata da 1.9) Nota: Questo passo è quello di trasferire il pellet in un contenitore più piccolo. Centrifugare le provette Falcon a 2,000 g per 8 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante per decantazione. Re-centrifugare le provette Falcon a 2.000 g per 2 min a 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante residuo pipetta. Tenere su ghiaccio. Pesare fi nostri tubi Falcon con pellet e messa record nella tabella 3. Calcolo della massa pellet, S30A polmone necessario, e la massa di perline necessari sulla base delle formule specifiche in Tabella 3. Carico e tallone corretto battito del pellet è fondamentale per rendere estratto di qualità, ed è il passo più difficile. Si consiglia di rivedere il video prima di tentare. Il mancato evitare bolle d'aria e distribuire uniformemente perline si tradurrà in estratto inefficiente. Aggiungere la quantità di tampone S30A calcolato in Tabella 3 per ogni provetta Falcon, vortex fino omogeneo, e ritorno in ghiaccio. Pur mantenendo le altre provette Falcon su ghiaccio, aggiungere perline intermittenza per un unico tubo Falcon in tre aliquote, ciascuno utilizzando 1/3 del totale delle perline. Dopo l'aggiunta di ciascuna aliquota di perline, vortex per 30 sec. Posizionare il tubo Falcon su ghiaccio tra gradini vortex e dopo vortice finale. Dopo aver aggiunto l'ultima aliquota, garantireperle sono uniformemente distribuite. Una pasta spessa dovrebbe essere formato. Preparare un 5 ml (volume) punta della pipetta tagliando la fine con una lama di rasoio sterile per creare un'apertura 3-4 mm. Comporre pipetta 2 ml Nota: Diversi set pipetta e suggerimenti forniscono diverse quantità di aspirazione, che non può essere sufficiente per tirare e rilasciare soluzioni perline celle di spessore; una pipetta da 1 ml con estremità rimosso può essere utilizzato in sostituzione.. Mettere 20 tubi bead-battendo sul ghiaccio. Verificare alta viscosità della soluzione in cella stallonatore usando pipetta modificato. Dovrebbe essere viscoso al punto di appena esce dalla punta della pipetta durante l'espulsione. Se troppo viscoso, regolare puntale in base al punto 1.25. Se non abbastanza viscoso, sfere possono essere aggiunti in incrementi di (massa pellet * 0,05), ad una massa massima di (massa pellet * 5.1). Dopo ogni aggiunta di perline, vortex per 30 sec e ritorno al ghiaccio. Vedere la Figura 3a per una dimostrazione di viscosità. Rimuovere la soluzione bead-cella dal tubo Falcon con pipetta modificata, e trasferire in un tubo tallone battendo sterile, riempiendolo per tre quarti con la soluzione tallone-cell. Spin estremamente breve (1 sec) su un contatore mini-centrifuga per eliminare le bolle d'aria, senza ridistribuire perline. Vedere le figure 3b-d per le immagini fisse di tubo tallone-pestaggio carico. Finire aggiungendo soluzione tallone-cell per formare un menisco concavo. Aggiungere una piccola goccia di soluzione bead-cellule sulla parte interna di un tappo tubo tallone battere, facendo attenzione a non impedire il labbro esterno del tappo, altrimenti il tubo tallone battendo non si chiude sufficientl y. Toccare il tappo su una superficie piana e verificare che non vi siano bolle d'aria sul fondo del tappo. Tappare il tubo tallone battendo con il tappo-tallone battere dal passaggio precedente. Mano per assistente cordone pestaggio. Se fatto correttamente, il coperchio deve essere chiuso ermeticamente, senza bolle d'aria should essere visibile, e poco (se presente) la soluzione tallone-cell dovrebbe traboccare. Ripeti il ​​processo di caricamento se bolle d'aria sono visibili o il tappo non fa chiudere completamente. Vortex tubo Falcon dal punto 1.24 con il restante soluzione di sfere celle per assicurare una distribuzione uniforme di perline. Ripetere i passaggi 1,28-1,31 fino a quando il tubo Falcon è vuota, quindi ripetere i passaggi 1,24-1,31 per ogni provetta Falcon supplementare. Condotta passi 1,33-1,38 contemporaneamente. Hanno assistente take compilato tallone battendo tubi da 1.31 e posto sul ghiaccio. Dopo due tubi-tallone battendo pieni sono stati raccolti e sono stati in ghiaccio per almeno un minuto, cominciare tallone pestaggio. Batti un tubo per 30 sec a 46 giri al minuto. Mettere a testa in giù sul ghiaccio per 30 secondi mentre battendo l'altro tubo. Ripetere passaggio precedente tale che ogni tubo tallone battendo pieno è stato battuto per 1 min totale. Ripetere i passaggi 1,33-1,35 fino a 8 tubi bead-battendo pieni (o l'importo massimo della centrifuga può contenere) have stati elaborati. Poi, costruire apparecchio filtrante da 15 ml Falcon (figura 3e). Aggiungere un nuovo tappo tallone battere, TV a parte a faccia in su, al fondo di un 15 ml Falcon. Quindi, rimuovere il tappo dal tubo tallone battere elaborati e premere colonna micro-cromatografia saldamente sulla fine del tubo tallone battere elaborati fino completamente sigillato. Snap off fine eluizione della colonna micro-cromatografia, e posizionare colonna micro-cromatografia, eluizione finisce giù, in tubo tallone-bordare vuoto. Inserire questo complesso in 15 ml Falcon. Ripetere l'operazione per tutte le 8 tubi-perline battendo pieni; tenere su ghiaccio al termine. Centrifuga 8 apparati di filtro, tubo Falcon livellata, a 6.000 g per 5 minuti a 4 ° C per separare estratto e pellet da perline. Verificare che ogni tubo tallone-pestaggio ha prodotto estratto praticabile. Estratto Correttamente battere non sarà torbido, e il pellet avrà due strati distinti. Eliminare tutte le provette torbidi, e trasferire il surnatante dai tubi non-torbide into singoli 1,75 ml provette micro-centrifuga, prendendo come poco pellet possibile. Tenere su ghiaccio finché non sono stati elaborati tutti i tubi-perline battere. Vedere la Figura 3f confrontando un tubo tallone-pestaggio correttamente vs correttamente elaborato. Provette a micro-centrifuga dal punto precedente a 12.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante privo di pellet in tubi bead-battendo vuoti utilizzando una pipetta, consolidando 500 microlitri in un nuovo tubo tallone battere. Incubare passaggio precedente, con tappi-perline battendo rimossi, a 220 rpm, 37 ° C per 80 min. Questo passaggio digerisce restante acidi nucleici utilizzando esonuleasi endogeni rilasciati durante il processo tallone-bordare, e può essere fatto in piedi tubo tallone battendo in una provetta di coltura tissutale. Preparare i materiali per dialisi. Completa S30B preparazione tampone aggiungendo 2 ml di 1 M DTT a 2 L di S30B precedentemente preparato. Mescolare e aggiungere 900 ml in ciascuna delle due sterile 1 L bicchieri. Aggiungi sterile agitatore magnetico in ogni bicchiere, conservare a 4 ° C. Dopo il punto 1.41, estratto dovrebbe apparire torbida. Consolidare estratto in 1,5 ml aliquote a 1,75 ml provette micro-centrifuga e centrifugare a 12000 g per 10 minuti a 4 ° C. Usando una pipetta, consolidare surnatante privo di pellet in 15 ml provette Falcon su ghiaccio, e mescolare bene dalla tappatura tubo e inversione. Save 10 ml di surnatante in ghiaccio per passo 1.47. Determinare la quantità totale di estratto prodotto, e idratare il numero necessario di 10k MWCO cassette dialisi mediante submersing in S30B per 2 min, assumendo 2,5 ml di estratto per cassette. Caricare cassette con 2,5 ml di estratto. Ogni bicchiere può richiedere fino a 2 cassetti, Dializzare, mescolando, a 4 ° C per 3 ore Nota: il carico parziale di cassette è accettabile.. Dialisi aumenta proteina resa di produzione. Durante il passaggio precedente, caratterizzare proteine ​​estrattoconcentrazione con un saggio di Bradford, utilizzando estratto salvato nel passo 1,44. Vedi supplementare Materiale 2 per i dettagli. Dopo la dialisi è completa, estratto aliquota di 1,5 ml a 1,75 ml provette micro-centrifuga. Centrifugare a 12.000 g per 10 min a 4 ° C. Un pellet formerà sul fondo della provetta. Consolidare surnatante limpido dal punto precedente pipettando in una provetta Falcon 15 ml sul ghiaccio. Omogeneizzare capovolgendo 5-10x. Sulla base di concentrazione determinato dalla Bradford nel passaggio 1.47, determinare quantità di estratto di aliquota in singoli 1,75 ml provette. Ogni singolo tubo deve avere un volume di 810-900 mg di proteina totale. Estratto dovrebbe avere una concentrazione totale di proteine ​​superiore a 27 mg / ml. Questo passaggio richiede assistenza per condurre speditamente Nota:. Estratto Aliquotare inferiore a 30 mg / ml in 30 microlitri aliquote, e la scala se la concentrazione è più elevata, ad esempio, estratto aliquota a 28 mg / ml da 30 microlitri, ed estratto aliquota al 32mg / ml del 28,1 microlitri. Estratto Aliquota passo successivo 1.50, avendo cura di evitare bolle. Estratto Flash-congelamento in azoto liquido Nota:. Aliquote con bolle possono essere rimosse per centrifugazione a 10.000 xg per 30 sec a 4 ° C. Rimuovere i tubi di azoto liquido con un colino e memorizzare immediatamente a -80 ° C. Sicurezza: Indossare occhiali protettivi, i tappi di estrarre tubi possono venire fuori a causa della differenza di temperatura tra l'azoto liquido e temperatura ambiente. 2. Amino Acid Solution Preparazione Amino Acid soluzione deve essere preparata in massa. La ricetta che segue utilizza un kit completo di RTS Amino Acid Sampler, fornendo sufficienti per circa 11.000 singole reazioni. Se ridimensionamento, si consiglia di utilizzare non meno della metà di un kit. Ogni amminoacido nella stock è alimentato a 1,5 ml, 168 mm, ad eccezione di leucina a 140 mm. La composizione finale del Amino Acid Solution è:leucina, 5 mM, tutti gli altri amminoacidi, 6 mM. Questo è 4x concentrazione di lavoro. Rimuovere tutti i 20 aminoacidi tra -20 ° C e scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelate, vortex fino aminoacidi dissolvono, incubando a 37 ° C, se necessario. Dopo amminoacidi vengono sciolti, mettere tutti gli amminoacidi in ghiaccio tranne Asn, Phe, e Cys, che vengono mantenute a temperatura ambiente. Cys potrebbero non dissolversi completamente. Su ghiaccio, aggiungere 12 ml di acqua sterile per una sterile 50 ml tubo Falcon. Aggiungere 1,5 ml di ciascun amminoacido nel seguente ordine, avendo cura di agitare la provetta Falcon dopo ogni aggiunta e di mantenere la soluzione sul ghiaccio: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys possono essere aggiunti come una sospensione. Dopo l'aggiunta, vortice finché soluzione è relativamente chiaro, incubando a 37 ° C, se necessario. Cys potrebbero non dissolversi completamente. Aliquota Amino Acid Soluzione in 50 tubi in26 ml ciascuno su ghiaccio. Aliquota del resto a 500 ml per provetta su ghiaccio. I 26 microlitri aliquote saranno utilizzati per calibrare estratto, mentre verranno utilizzate le aliquote microlitri 500 per la preparazione di buffer. Mentre la suddivisione in aliquote, vortice lo stock principale frequentemente per evitare la distribuzione ineguale della sospensione. Aliquote freeze flash in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Sicurezza: Indossare occhiali protettivi, i tappi di estrarre tubi possono venire fuori a causa della differenza di temperatura tra l'azoto liquido e temperatura ambiente. Optional: Condurre un saggio di attività della neo-made Amino Acid Solution contro precedentemente effettuate Solutions aminoacidi. 3. Soluzione Preparazione Energy Energy Solution è utilizzato sia per la calibrazione estratto cellulare grezzo e per la creazione di buffer, e dovrebbe essere preparato in massa. La ricetta che segue fornisce sufficiente per circa 10.000 singole reazioni. Se il ridimensionamento, è recommeNDED utilizzare non meno di 1/24 dei valori qui indicati. Come l'Energy Solution è un costo monetario significativo, gli utenti prima volta può decidere di preparare a scala 1/24. La composizione finale di Energy Solution è: HEPES pH 8 700 mm, ATP 21 mm, 21 mm GTP, CTP 12,6 millimetri, UTP 12,6 millimetri, tRNA 2,8 mg / ml, 3,64 mM CoA, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mm, acido folico 0,95 mm, spermidina 14 mm, 3-PGA 420 mm. Questo è 14x concentrazione di lavoro. Se lo si desidera, ogni elemento individuale nella tabella 4 può essere conservato a -80 ° C per un uso successivo. Rimuovere tutte le sostanze chimiche in Tabella 4 da -80 ° C, -20 ° C, o 4 ° C a temperatura ambiente per 30 min. Preparare soluzioni madre come descritto nella Tabella 4. Vedi supplementare Materiale 1 per le ricette. Mettere tutte le soluzioni sul ghiaccio dopo la preparazione. In un tubo Falcon da 15 ml, aggiungere nel seguente ordine, avendo cura di agitare la provetta Falcon dopo ogni aggiunta e per mantenere le soluzioni on ghiaccio: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 microlitri di acqua, 1,39 ml nucleotide mix, 576 microlitri 50 mg / ml tRNA, 576 microlitri 65 CoA mM, 276 microlitri NAD 175 mm, 170 ml 650 cAMP mM, 288 ml 33,9 di acido folinico mM , 144 ml 1 M spermidina, e 3,09 ml di 1,4 M 3-PGA. Aliquota Energy Solution in 50 tubi in 7 ml ciascuno su ghiaccio. Aliquota del resto a 150 ml per provetta su ghiaccio. I 7 aliquote microlitri saranno utilizzati per calibrare estratto, mentre verranno utilizzate le aliquote di 150 microlitri per la preparazione di buffer. Mentre la suddivisione in aliquote, vortice il titolo principale di frequente. Aliquote freeze flash in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Sicurezza: Indossare occhiali protettivi, i tappi di estrarre tubi possono venire fuori a causa della differenza di temperatura tra l'azoto liquido e temperatura ambiente. Optional: Condurre un saggio di attività di recente fatto Energy Solution contro precedentemente fatte Energy Solutions. 4. Buffer Preparazione Buffer Preparazione richiede il completamento di Cell greggio Estrarre Preparazione, Amino Acid Solution preparazione, e la soluzione Preparazione energia. Ogni buffer è unico per una partita di estratto cellulare grezzo. Mg-glutammato, K-glutammato e DTT (in questo ordine) sono ottimizzati in questa sezione per produrre reazioni con i massimi livelli di espressione. Il protocollo che segue utilizza un modello di pre-scritta, TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx (Supplemental materiale 3), per calibrare estratto di cellule greggio pre-preparati e preparare buffer. Tuttavia, si può anche calibrare estratto cellulare grezzo e preparare tampone senza il modello ottimizzando Mg-glutammato, K-glutammato e DTT manualmente e la creazione di buffer tale che insieme con l'estratto, è il 75% di un volume totale di reazione. Se la calibrazione manualmente, condizioni di reazione finali possono essere trovate al punto 5. Completa il modulo "Dati Generali". Scongelare su ghiaccio 100 mM Mg-glutammato (4 ° C), 3 M K-glutammato (4 ° C), 6mM Amino Acid Solution (26 microlitri, -80 ° C), Energy Solution (7 ml, -80 ° C), DTT 100 mM (-20 ° C), DNA di controllo positivo (-20 ° C), 40% PEG- . 8000 (4 ° C), estratto di cellule greggio (-80 ° C) e acqua (4 ° C) Nota: Utilizzare 1 nM concentrazione di lavoro pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmide 40019) per il controllo positivo (eccitazione 485 nm, emissione 525 nm), o un altro riferimento che produce intensità di segnale. 4 Preparare sette 10.5 reazioni microlitri, testando una serie di 4-10 mm Altre Mg-glutammato, aliquotandolo set quantità di magazzino Mg-glutammato in tubi micro-centrifuga individuali. Nota: Sebbene 10.5 reazioni microlitri sono inizialmente preparate, la reazione finale è di 10 microlitri. Preparare master mix come indicato nel modello sotto "calibrazione Mg-glutammato", aggiungendo un extra di 80 mm di K-glutammato. Tenere su ghiaccio e vortex dopo l'aggiunta di ciascun elemento Nota:. I valori qui e nel modello sono riportatioltre alle quantità di Mg-glutammato, K-glutammato, e TDT presenti nel buffer S30B usato per fare estratto cellulare grezzo. Aggiungi mix master campioni contenenti Mg-glutammato e preparare le reazioni. Vedere i passaggi 5,10-5,13 per le istruzioni dettagliate. Eseguire reazione a 29 ° C, sia in un incubatore o un lettore di piastre. . Determinare la concentrazione ottimale Mg-glutammato per livello di end-espressione e la velocità massima di espressione della proteina (Figura 4a) Nota: Tempi di esecuzione variano a seconda dell'esperimento, ma in genere l'ultima in 8 ore. Ripetere i passaggi 4,2-4,7 per K-glutammato nella sezione "calibrazione K-glutammato", che definisce i tenori Mg-glutammato a quelli trovati nella fase 4.7. Ripetere i passaggi 4,2-4,7 per il digitale terrestre in "calibrazione DTT", che definisce i tenori Mg-glutammato a quelli trovati nel passo 4.7 e livelli di K-glutammato a quelli trovati nel passaggio 4.8. Nota: Abbiamo scoperto che ha aggiunto DTT non influisce significativamente end- livelli di espressione. Usavalori trovati in calibrazione sotto "composizione Buffer" per determinare la composizione di tampone per essere preparati. In base alla quantità di estratto cellulare greggio prodotto, una ricetta master mix è prodotto per una determinata quantità di buffer. Scongelare aliquote elencate in master ricetta mix su ghiaccio. Una volta scongelato, preparare master mix, mantenendo su ghiaccio e vortex dopo l'aggiunta di ogni elemento. Aliquota per importo indicato alla voce "la composizione Buffer". Tubi tampone Flash-freeze in azoto liquido. Mentre la suddivisione in aliquote, vortice lo stock principale di frequente. Rimuovere i tubi di azoto liquido con un colino e memorizzare immediatamente a -80 ° C. Sicurezza: Indossare occhiali protettivi, i tappi di estrarre tubi possono venire fuori a causa della differenza di temperatura tra l'azoto liquido e temperatura ambiente. 5. Esecuzione sperimentale di una reazione TX-TL Condizioni di reazione finali sono: 8,9-9,9 mg / ml prin (da estratto grezzo), 4,5 MM-10.5 mM Mg-glutammato, 40-160 mm K-glutammato, 0,33-3,33 mM DTT, 1.5 mM ogni amminoacido tranne leucina, leucina mM 1,25, 50 HEPES mM, ATP 1,5 mM e GTP, CTP 0.9 mM e UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 CoA mM, 0,33 mM NAD, 0.75 cAMP mM, 0,068 mM acido folico, 1 spermidina mM, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000. A TX base -TL reazione ha 3 parti (tubi): estratto di cellule greggio, tampone, e DNA. Il rapporto è: 75% tampone ed estratto, il 25% del DNA Le reazioni possono variare di volume, e usiamo 10 microlitri per convenzione per minimizzare il volume di reazione e consentire l'esecuzione in una piastra a 384 pozzetti.. Volumi più grandi richiedono agitazione per una corretta ossigenazione. Il protocollo che segue utilizza un modello di pre-scritta, TXTL_JoVE.xlsx (Supplemental Material 4), per condurre una reazione di 10 microlitri. Articoli in viola indicano i valori di input utente, e gli elementi in blu indicano i reagenti supplementari da aggiungere alla reazione. Tuttavia, si può anche effettuare uno spirito di reazioneHout il modello seguendo condizioni di reazione descritte sopra. Completa il modulo "Dati Generali". Sotto "Mix Preparazione Maestro", inserire il valore percentuale estratto dal punto 4.1 nella scatola viola. Progetta il tuo esperimento in silico utilizzando il "Mix preparazione Master" (righe 10-17) e "Preparazione del DNA" (righe 19-50) sezioni. In generale, le costanti possono essere messi nella sezione "Mix Preparazione Master", mentre le variabili possono essere messi nella sezione "Preparazione del DNA". Riduci campioni per esperimento per evitare l'evaporazione del campione e sperimentale, tempo di polarizzazione di inizio. Vedere la Figura 6 per una configurazione di esempio. Sotto "Mix Preparazione Maestro", aggiungere i reagenti, quali induttori o proteine, che andranno in tutti i campioni ad una concentrazione costante. Partendo con la riga 14, compilare le aree ombreggiate blu, mantenendo un reagente per ogni riga. Le unità sono rapporti relativi. In "Preparazione del DNA", DNA aggiungere che sarà specif campioneic. ID campione # 1 e # 2, corrispondenti a controlli positivi e negativi, rispettivamente. ID campione # 3 e soprattutto sono modificabili dall'utente per il DNA, la concentrazione magazzino in ng / ml, la lunghezza in paia di basi, la concentrazione finale desiderata in Nm, e ripetizioni (di 10 reazioni microlitri). La quantità di azioni DNA per raggiungere la concentrazione finale desiderata viene calcolato automaticamente. . Il totale di tutti i somme delle righe di 10.5 * n, dove n è il numero di ripetizioni Nota: Sebbene il volume finale di reazione è 10 microlitri, i calcoli assumono un volume totale di 10,5 microlitri per reazione, per tenere conto di volume perso durante il pipettaggio. In "Preparazione del DNA," aggiungere reagenti o DNA complementare che sarà specifico campione colonne blu. Concentrazioni di DNA Archivio in Nm possono essere calcolati in "Preparazione del DNA", mentre reagenti specifici esempio richiedono il calcolo manuale basato su un volume totale di reazione di 10.5 * n. I volumi immessi vengono sottratti dal volume d'acqua della stessa riga. Rimuovere numbe necessariar di tubi di tampone, estratto di cellule greggio, e il controllo positivo sotto "Tubes per scongelare," di -20 ° C o -80 ° C e scongelare il ghiaccio. Preparare campioni di DNA. Per ogni ID esempio, un'aliquota il DNA indicata, l'acqua e gli elementi forniti dall'utente per la sezione "Preparazione del DNA" in un tubo micro-centrifuga, a temperatura ambiente. Nota: per evitare la perdita di campione, di recente tarati e pipette basso-stick Si raccomanda puntali per pipette e provette micro-centrifuga. Quando i tubi dal punto 5.7 vengono scongelati, preparare il master mix costituito da tampone, estratto, e tutti gli elementi forniti dall'utente globali basate sulle caselle ombreggiate arancio, mantenendo su ghiaccio e vortex dopo l'aggiunta di ogni elemento. Nota: Extract è estremamente viscoso. Aliquote con bolle possono essere rimosse per centrifugazione a 10.000 xg per 30 sec a 4 ° C. Aggiungere la quantità di master mix indicato nelle cellule arancione in "Preparazione del DNA" (colonna O) per ogni campione di DNA, e mantenere a temperaturature. Trattare questo come l'ora di inizio di reazione. Vortex ogni campione, e centrifugare a 10.000 xg per 30 secondi a temperatura ambiente per abbattere qualsiasi campione residuo e per ridurre bolle. Se conducendo la reazione in tubi micro-centrifuga, incubare direttamente a 29 ° C. . Altrimenti, pipetta 10 ml di campione in una piastra da 384 pozzetti Nota: Le reazioni in volumi superiori a 10 ml possono richiedere l'agitazione per l'ossigenazione. Piastra centrifugare a 4000 xg per 30 secondi a temperatura ambiente per abbattere qualsiasi campione residuo e per ridurre bolle. Sigillare piastra poi per evitare l'evaporazione. Eseguire reazione a 29 ° C. Nota: Tempi di esecuzione variano a seconda dell'esperimento, ma in genere durano meno di 8 ore.