마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

1. 장비의 준비 : 유량 용기, 피펫, 및 솔루션 실 유량 : 절연 endothelial 튜브 (그림 1A 참조) superfuse려면 왼편에 24mm X 50mm 유리 커버 슬립으로 흐름 챔버를 사용합니다. 챔버를 조립하기 전에, 3 % 염산 70 % 에탄올로 두 유리 커버 슬립을 흘려 초순수로 린스하고, 질소 가스로 건조. 피펫 : 피펫의 세 가지 다른 종류의 프로토콜 중에 사용되는 : 삽관, 분쇄, 및 고정. 삽관 및 피닝 피펫 모두 실험 일 전에 제조 될 수 있지만, 분쇄 피펫은 적절 루멘 크기 용기의 직경의 지식을 필요로의 일해야한다. 삽관 피펫 : 루멘에서 적혈구를 플러시 긴 테이퍼 단부를 가지고 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 보로 실리케이트 유리 모세관 튜브를 당겨 위하여. ~ 외경 집게로 단부 브레이크 30 % 르동맥 (~ 50 ~ 80 μm의), 화재 광택 부드러운 될 수있는 팁 (그림 1B 참조)보다 SS. 약 45 °로도 각 피펫의 팁을에 도움이됩니다. 연화 피펫 : 기계적으로, 내피 관에서 평활근 세포 외막을 해리 붕규산 유리 모세관 튜브에서 triturating 피펫을 만들 수 있습니다. 위와 같이 모세관 튜브를 준비하고 집게로 끝을 휴식. 팁 : 쉽게 깨끗하게 분쇄 피펫 유리의 두꺼운 벽을 깰 수 있도록 유리 채점 장치를 사용하십시오. 내피 튜브가 고립 될으로부터 용기의 외경보다 약 10 ~ 20 ㎛의 더 큰 실험 당일 결정된 내경에 피펫을 휴식. 화재 광택 깨진 끝 매끄러운 때까지 (그림 1C 참조). 피펫 피닝 : 유동 챔버 내의 내피 관을 안정화하기 위해, 내피 t 확보 피펫을 고정 할챔버의 커버 슬립 바닥에 우베. 삽관 피펫과 동일한 방법으로 유리 모세관 튜브를 당겨. 끝을 밀봉 할 때까지 ~ ​​100 μm의 직경, 및 화재 폴란드 집게로 끝을 휴식, 둥근 부드러운 (그림 1D 참조). 주 : 피닝 피펫 팁이 완전히 밀봉되지 않은 경우, 유체는 루멘을 입력하고 실험 결과를 혼동있다. 솔루션 : 고순도의 모든 솔루션 (18.2 MΩ) H 2 O를 준비하고 0.2 μm의 필터를 통해 살균. 용액의 삼투압은 285-300 mOsm 사이에 있는지 확인합니다. 4 ℃에서 저장 될 때 솔루션은 약 2 주간 좋은 유지 박리 액 : 뛰어난 상복부 동맥 절개 중에 사용 염 용액 (밀리몰 / L 소재)로 구성된다 : (137)의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 N-2-히드 록시 에틸-N'-2-에탄 술폰산 ( HEPES), 글루코스 (10), 0.01 소듐 니트 로프 루시드 (SNP)D 0.1 % 소 혈청 7.4의 pH와 알부민 (BSA). NO 공여체 SNP는 동맥 cannulate하고 분쇄​​ 중에 평활근 세포의 제거를 용이하게하기 위하여 쉽게들을 만들고 따라서, 평활근 세포를 이완 돕기 ​​위하여 포함된다. 해리 용액 : 내피 관의 해리시 사용되는 염 용액 (밀리몰 / L 소재)로 구성된다 : (137)의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 HEPES, 10 글루코스, 2 염화칼슘, 및 0.1 % BSA, 7.4의 pH. 이 버퍼의 1 ㎖ 분취 량을 추가, 0.62 ㎎ / ㎖ 파파인, 1.5 ㎎ / ㎖ 콜라 1.0 ㎎ / ㎖ 디티 오 에리트 리톨을. 다른 공급 업체의 효소는 효소 활성의 다양한 수준을 가질 수 있기 때문에,이 작품에 사용되는의 제품 번호는 재료의 테이블에 참조 용으로 포함되어 있습니다. 참고 : 프로토콜 동안 효소 분리 버퍼와 해리 버퍼 모두가 서로 다른 단계에서 사용된다. Superfusion 솔루션 : superfusin에 사용되는 생리 식염수 (PSS)G 고립 된 내피 관 (밀리몰 / L의)로 구성되어있다 : 137의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 HEPES, 7.4의 pH 10 포도당과 2 염화칼슘 2. 수술 절차를 시작하기 전에 버퍼 및 솔루션을 준비합니다. 200 ㎖의 삼각 플라스크에 4 ° C와 나누어지는 해부 버퍼 50 ㎖에서 솔루션을 제거하고 얼음에 놓습니다. 또한, 해리의 나누어지는 50 ML 효소없이 버퍼 실온으로 평형을 벤치 위에 놓습니다. 4 ° C에서 superfusion 솔루션을 제거하고 벤치 위에 실온으로 평형을 할 수 있습니다. 2. 동물 준비 동물과 관련된 모든 절차 및 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 맞는 있는지 확인하십시오. 여기에서 설명하는 절차는 대학의 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다미주리. 남성 또는 적어도 9 주 이전 암컷 생쥐를 사용하여 개별적으로 연구. 복강 내 (IP) 주입을 통해 펜토 바르 비탈 나트륨 (60 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 팁 : 주입은 과다 복용의 가능성을 감소하기 전에 멸균 식염수에 10 ㎎ / ㎖로 펜토 바르 비탈을 희석. 마취는 즉시 펜 토바 비탈의 첫 번째 주사 후 온도 조절을 타협, 그래서 따뜻하게 마우스를 유지. (~ 37 ° C로 보정) 가열판 위에 금속 캐리어 (통풍 알루미늄 바구니)를 사용하여 안정적인 마우스의 온도를 유지하기 위해 잘 작동합니다. 또한, 마우스에서 적절한 거리에서 그것의 위치를​​주의하면서 가열 램프를 사용합니다. 마취의 적절한 수준 (발가락이나 꼬리 핀치에 철수의 부족)에 도달 할 때까지 마우스마다 5 ~ 10 분을 모니터링합니다. 보충 투여 량은 15 ~ 20 분 후에해야 할 수 있습니다. 그것은 특히, 비만 세, 또는 동물과 함께 과다 복용을 방지하기 위해 천천히 그리고 신중하게 진행하는 것이 가장 좋습니다그렇지 않으면 스트레스들. 조심스럽게 작은 애완 동물의 털 가위로 면도 복부 측면에서 머리를 제거합니다. 특별한주의는 동물에게 외상을 방지하기 위해주의해야한다. 그것은 음모 지역에 겨드랑이에 걸친 영역에서 모두 머리를 제거하는 것이 도움이된다. 신선한 알코올 면봉으로 어떤 느슨하게 달라 붙는 머리카락을 제거합니다. 가능한 한 복부 벽의 많은 부분을 노출 퍼져 모두 앞과 뒷다리 거짓말, 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 필요하다면, 확산 – 이글 방식으로 다리를 고정 실험실 테이프를 사용한다. 3. 우수한 상복부 동맥의 분리 단지 음모 영역의 면적 위의 피부를 통해 작은 절개를합니다. 기본 복부 근육에 손상을 피하는 동안 만 피부가 절단되고 있음을 확인, 각각의 뒷다리 밖으로 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다. rostrally 복부 흉곽의 상단에 정중선과 함께 절개를 계속N 각각의 앞발에 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다. 피부를 부드럽게 들어 올려 결합 조직 (그림 3A 참조)하여 복부 근육의 전체 표면을 노출, 기본 근육에 피부를 유지 절단 가위를 사용합니다. 실온 0.9 % 식염수로 노출 근육 관개. 바다의 작은 크기로 인해, 추가 절차에 대한 실체 현미경 아래에 동물을 배치합니다. 집게로 흉골의 아래쪽에있는 지방 패드를 들어 올리고 그것을 통해 절개를합니다. 기본 조직에 너무 깊이 잘라하지 않도록하고, 하부 늑골을 따라 절개를 계속합니다. 바다는 볼 수 있어야합니다, 그것은 손상되지 않도록주의하십시오. 절개가 완료되면, 실온 0.9 % 식염수로 노출 된 조직 관개. 골격근의 상부층이 후퇴 한 후에, SEA 및 내부 근육 쉽게 식별된다. 팁 : 길이의 주원래 길이를 대략적으로 (분리에 자신의 축을 따라 단축) 내피 관을 확장하는 분리하기 전에 생체 내에서 SEA. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게 SEA 아래의 얇은 근육층을 절개. 각진 겸자를 사용하여 밑에 SEA 6-0 실크 봉합사의 길이를 통과하고 가압 및 후속 분리 및 세정 중에 시각화를 용이하게하기 위해 혈관 내강 안에 보유 혈액 보관하는 동맥과 정맥을 결찰 인접. 반대쪽에서 바다 결찰 절차를 반복합니다. 모두 SEA는 결찰 한 후, 각각의 측면을 분리하는 복부 근육의 중간 선을 따라 절개를합니다. 피부를위한 수행과 완전히 몸에서 복부 근육을 분리하는 수직 바깥 가장자리를 따라 절개를 계속 한 후, 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다. 가압 루멘을 유지하기 위해 바다로 공급 혈관의 손상을 방지. C밀봉을 유지하기 위해 결찰 위의 바다, 유타, 4 ° C 해부 버퍼 10 ㎖를 포함하는 50 ㎖의 비이커에 고립 된 근육과 동맥을 배치합니다. 복부의 다른 측면에 대해 절차를 반복하고 10 분 동안 절개 버퍼에서 조직을 배양한다. (그림 (b) 참조) 냉장 (4 ℃) 포함 해부 실 해부 버퍼에서 바다를 포함하는 복부 근육을 놓습니다. 해부 챔버 하단에 실 가드 (폴리 디 메칠 실록산 [PDMS])의 층으로 페트리 접시로 구성되어 있습니다. 곤충 핀 (0.15 mm)를 사용하여 생체 내 길이 (위에서 언급 한)을 대략하고 실 가드에 고정 고립 바다와 복부 근육을 스트레칭. 팁 : 같은 근육을 정위 복막에 직면 얇은 층이 상위에 있다고는 transillumination를 사용하여 바다를 쉽게 볼 수 있습니다. 미세 미세 절제 장비를 활용하고 향해 결찰의 상류 사이트에서 작업하류 단, 최초의 주요 분기 사이트 (1-2 CM) 때까지 짝을 정맥 주위 조직에서 바다의 선택을 취소합니다. 그럼 그냥 분기 사이트 위에 그냥 내고 아래를 절단하여 바다를 절제. 혈관 내강 내에서 유지 혈액을 제거하려면, 바다를 cannulate 얼음 차가운 해부 버퍼로 세척합니다. 실라 스틱 튜브의 조각을 사용하면, 차가운 얼음 해부 버퍼를 포함하는 5 ML의 주사기에 삽관 피펫의 뒤쪽 끝을 연결하고 바다를 cannulate하는 해부 챔버 내에서 팁의 위치를​​ 미세 조작기의 마이크로 피펫을 확보. 적혈구의 모두가 플러시되면, 삽관 피펫에서 바다를 제거하고 해부 접시 밖으로 피펫을 올립니다. 작은 세그먼트로의 길이는 각 1-3밀리미터을 SEA를 잘라. 이러한 짧은 세그먼트 내피 튜브의 분리를 용이하게한다. 4. 내피 튜브의 분리 12mm X 75mm 유리 컬트 채우기차가운 얼음 해부 버퍼 우레 관을 반 누름합니다. 기울어 진 집게를 사용하여, 문화 튜브에 동맥 조각을 전송하고 얼음에 배치합니다. 이때, 별도의 12mm X 75mm 배양 튜브에서 1 ㎖의 최종 부피로 해리 완충액으로 소화 효소를 결합 (1.3.2 해법 참조)와 가열 블록을 37 ° C로 용액을 예열. 해리 버퍼와 효소가 예열되는 동안, 조심스럽게 용기 세그먼트를 포함하는 작은 볼륨을 떠나는 문화 튜브에서 해부 버퍼를 대기음. 조심스럽게 남아 해부 버퍼를 씻어 효소없이 상온 해리 버퍼를 추가합니다. 팁 : 동맥 조각들을 재 정착을 기다리는 시간을 절약하기 위해 문화 튜브의 바닥에 남아 해리 버퍼가 천천히 같은 추가합니다. 충격을 최소화하기 위해 37 ° C에, 실온 (~ 24 ° C)에, 얼음 (4 ℃)에서 여러 단계를 통해 버퍼 온도를 올립니다. 조심스럽게 dissoc를 대기음iation은 선박 세그먼트를 포함하는 작은 볼륨을 남겨주십시오되고 다시, 문화 관에서 버퍼. 가열 블록으로부터 효소로 예열 해리 완충액을 제거 용기 세그먼트를 함유하는 배양 튜브에 효소 용액 1 ㎖을 전송하며, 가열 블록에 확대 배양 튜브를 배치. 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 효소 배양하는 동안, 분쇄 피펫을 준비 미네랄 오일로 가득 찰과 미세 조작기에 장착 된 마이크로 실린에 고정합니다. 그런 해리 버퍼의 2 NL과 피펫을 채우고 유량 용기에 피펫 팁의 위치를​​ 마이크로 실린 플런저를 철회. 30 분의 인큐베이션의 끝에, 가열 블럭에서 배양 튜브를 제거하고 신중 위와 버퍼 대기음. 실내 온도 해리 버퍼의 4 ㎖로 동맥 세그먼트를 씻으십시오. 참고 :이 선박 segm를 유지할 필요가 더 이상문화 튜브의 바닥에 행군, 동맥 조각을 방해 실제로 잔류 효소가 효과적으로 제거되어 있는지 확인하는 데 도움이됩니다. 완만 한 밀리리터 마이크로 피펫으로 흡입하고, 해리 완충액 1 ㎖를 유동 챔버에 배치하여 유동 챔버로 이동 한 용기 세그먼트. 마이크로 실린을 함유하는 미세 조작기를 이용하여, 용기 세그먼트의 일단 근처 분쇄 피펫의 선단을 위치. ECS의 기계적 변형을 유발 한 후 다시 챔버로 꺼내하지 않도록, triturating 피펫 천천히 (225 NL / 초)로 혈관 세그먼트 (회수 500 NL)를 대기음. 소화에 성공하면, 평활근 세포 및 외막은 내피 관으로부터 해리 될 것이다. 모든 평활근 세포가 분해 될 때까지 분쇄를 반복합니다. 과도한 분쇄 (4 배 이상)되는 EC 손상 및 효능에 응답하지 않는 렌더링 수 있다는 점에 유의해야합니다. 팁 :분쇄 피펫을 사용하여, 튜브를 얽히게에서 그것을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 멀리 내피 관에서 외막 이동합니다. 주 : 분쇄 피펫을 사용하여, 절연 내피 관은 흡입 및 분리 챔버로 이송 될 수있다. 흐름의 방향을 따라 정렬 유량 용기의 중심에있는 내피 튜브를 놓고 triturating 피펫을 제거합니다. 미세 조작기의 보안 피닝 피펫은 유량 용기의 양쪽 끝에 장착하고, 내피 튜브의 양단에 자신의 팁을 배치합니다. 챔버의 바닥에 그것을 눌러 튜브의 한쪽 끝을 통해 고정 피펫을 낮 춥니 다. 튜브의 대향 단부에 같은 방식으로 제 피닝 피펫을 위치. 참고 : 피닝 피펫의 위치는 트레이드 오프 튜브 (멀리 튜브의 끝에서 그들을 배치)를 확보하고 더 많은 영상 / 실험 지역 (가까운 튜브의 끝에 그들을 배치)를 허용 사이입니다. t 찾기옷자락 ~ 튜브의 각 끝에서 50 ㎛ 잘 작동합니다. 고정 피펫 튜브를 만지는 것처럼, 천천히함으로써 생체 내 길이에 근접하도록 확장, 관의 축 방향을 철회 한 후 튜브를 고정하는 실 바닥에 피펫을 누릅니다. superfusion 용액의 흐름을 시작하고 (도 3c 참조) 내피 관이 평형과 밀착하는 적어도 20 분 동안 휴식을 허용한다. 내피 관에 걸쳐 일정한 유체 흐름 (superfusion)을 유지하기 위해 연동 펌프를 사용한다. 참고 : 내피 관 유량 용기의 바닥 (~ 25 분)에 부착 또는 내피 튜브에서 이탈하지 않도록하기 위해 자리에 남아되면 고정하기 피펫을 제거 할 수 있습니다. 5. 염료로드 및 칼슘 이미징 , 세포 내 칼슘 반응을 시각화 실온에서 FLUO – 오전 4 염료로 내피 튜브를로드하려면 (~ 24 ° C). 욕실에서 유체의 흐름을 중지하고 FLUO-4를 추가10 μM의 최종 농도에서 챔버 AM. 다음 세포 염료를 제거하고 세포 내 염료가 완전히 탈 에스테르 화 된 보장하기 위해 20 분 동안 신선한 PSS와 내피 튜브를 superfuse, 색소 세포를 입력 할 수 있도록하기 위해 10 분을 기다립니다. 칼슘 이미징을 수행합니다. 이 작품의 경우, 직립 현미경은 회전 디스크 공 촛점 이미징 시스템을 갖추고 주변 환경의 온도에서 사용되었다 (그림 2 참조). 491 nm의 레이저 형광 칼슘 염료를 자극하고 강화 된 디지털 카메라를 사용하여 (500-550 nm의 방출에) 이미지를 수집.