Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales<em> In Vitro</em> Est considérablement améliorée en utilisant une chambre diffusion verticale du modèle

Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. L'utilisation de ces tests en culture cellulaire, l'adhérence des bactéries aux cellules hôtes, l'identification des récepteurs de la cellule hôte, la cellule hôte voies de signalisation et l'invasion bactérienne des cellules hôtes ont tous été étudiés en détail, ce qui entraîne de nombreuses observations importantes. Cependant, ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies qui peuvent ne pas être représentatifs de l'environnement in vivo. Une limite importante de modèles in vitro utilisés pour étudier les infections gastro-intestinales est que les conditions de culture, y compris des niveaux élevés d'oxygène sont généralement favorables à la survie des cellules eucaryotes. Toutefois, les conditions dans la lumière intestinale seront presque anaérobie. Pathogènes entériques dans un environnement très pauvre en oxygène expriment des gènes de virulence dont l'expression change dans des conditions aérobies ^2. Ainsi, les données obtenues en utilisant la norme de culture cellulaire modèles may donner une indication inexacte des interactions bactériennes avec des cellules hôtes.

Campylobacter jejuni est la principale agent causal de la gastro-entérite aiguë bactérienne dans le monde entier, avec des symptômes allant de la diarrhée légère à grave entérite inflammatoire. La majorité des C. jejuni infections suite à une gastro-entérite sans complication, cependant C. jejuni est également agent infectieux le plus souvent mentionné dans les neuropathies périphériques, y compris le syndrome de Guillain-Barré (SGB). Au Royaume-Uni, on estime qu'il ya plus de 500.000 cas d'entérite causées par C. jejuni chaque année avec un coût prévu de l'économie britannique de 580 millions de livres sterling. Dans le monde en développement, C. jejuni est la principale cause de mortalité chez les enfants. Malgré l'importance incontestable de l'infection à Campylobacter et des décennies de recherche, y compris l'analyse fondée sur la génomique complète, C. jejuni pathogénie est encore mal understood, contrairement à d'autres pathogènes entériques tels que Salmonella, Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae. L'absence d'un modèle pratique des petits animaux est l'une des principales raisons de cette ^3. Aussi le largement utilisé dans les modèles d'infection in vitro sont plus inapproprié pour étudier microaerophilic C. jejuni que pour d'autres pathogènes entériques qui sont anaérobies facultatives. Alors que C. jejuni est reconnu comme un pathogène invasif, les mécanismes de C. jejuni invasion des cellules épithéliales intestinales (SAVA) sont encore peu claire ^4,5. C. invasion jejuni a été montré pour être dépendant soit microfilaments, microtubules, une combinaison des deux, ou ni ^5. La confusion dans ce domaine est très probablement dû à l'utilisation d'inapproprié dans des conditions d'essai in vitro.

Un certain nombre d'essais de culture de cellules ont été utilisées pour étudier les interactions de C. jejuniavec des cellules hôtes. Caco-2 ⁶ INT 407 ^{7, 8} et T84 lignées cellulaires ont été utilisées pour étudier les capacités d'adhérence et l'invasion de différentes C. souches jejuni. Toutefois, les niveaux d'adhérence bactérienne et l'invasion de C. jejuni avec les IEC sont considérablement inférieurs à ceux des autres pathogènes entériques ^9. La co-culture de C. jejuni avec les IEC est normalement effectuée dans un incubateur à CO ₂ dans des conditions proches de la teneur en oxygène dans l'atmosphère, nécessaire pour la survie des CEI. C. l'expression du gène jejuni sera très différent dans l'environnement pauvre en oxygène de la lumière intestinale par rapport aux conditions de l'oxygène atmosphérique.

L'utilisation d'un système de chambre de diffusion verticale (VDC) a été développé qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz ^1,10,11 et moyennes. Ce système imite les conditions de vie dans l'intestin humain où les bactéries seront nonder conditions de très faible d'oxygène des tissus tout en seront alimentés en oxygène du sang. IEC monocouches polarisées cultivées dans des filtres de 0,4 um spéciaux ont été placés dans un VDC créant un compartiment apical et basolatéral, qui ont été remplis individuellement avec le bouillon bactérien et un milieu de culture de cellules, respectivement (figure 1). Le VCC a été placée dans l'atmosphère variables incubateur contenant 85% de N _2, 5% de O _2, et 10% de _CO2 à 37 ° C, ce qui représente les conditions optimales pour C. jejuni. Le compartiment apical a été laissée ouverte et exposée à l'atmosphère microaérobies à l'intérieur de l'atmosphère variables incubateur, tandis que le compartiment basolatéral scellé a été alimenté avec de l'oxygène par l'administration constant de 5% de CO ₂ / O mélange gazeux de 95% _2, avec un tube de sortie empêchant l'accumulation de pression . Caco-2 survie cellulaire et l'intégrité de la monocouche dans ces conditions ont été confirmées par le suivi élément transepithelialrésistance ctrical (TEER) à travers la monocouche de plus de 24 h de démontrer la survie des cellules Caco-2, la monocouche cellulaire et la séparation physique des compartiments basolatéral et apical dans des conditions pauvres en oxygène dans le compartiment apical. Le TEER de monocouches dans CDV entretenues dans l'atmosphère incubateur variable (conditions microaérobies) et dans une culture cellulaire CO ₂ incubateur standard (conditions aérobies) n'a pas montré de différences significatives, ce qui indique l'intégrité de la monocouche cellulaire sous différentes conditions atmosphériques ^1. Dans des conditions microaérobies, jonctions serrées sont restés présents et répartis uniformément entre les bordures de cellules avec un motif de coloration occludine similaire à des cellules maintenues dans des conditions aérobies ^1.

Les interactions de C. jejuni avec Caco-2 et T84 cellules dans le VDC a été étudiée en évaluant l'interaction bactérienne (adhésion et l'invasion) et l'invasion. Deux différente C. jejuni de type sauvage strains ont été utilisés ^1. C. jejuni 11168H est un dérivé hypermotile de la souche de la séquence originale NCTC11168. La souche 11168H montre les niveaux de colonisation beaucoup plus élevées dans un modèle de colonisation de poussin et est donc considérée comme une souche appropriée à utiliser pour les études sur les interactions hôte-pathogène. 81-176 est d'isoler un humain et est l'une des souches de laboratoire largement étudiés les plus envahissantes. C. souches jejuni ont été ajoutés au compartiment apical d'un VDC vertu soit des conditions micro-aérobies ou aérobie. Nous avons observé des taux plus élevés pour les deux interaction et l'invasion ont été enregistrées pour C. jejuni dans des conditions microaérobies ^1. L'augmentation C. interactions jejuni n'étaient pas dues à une augmentation du nombre de bactéries dans des conditions microaérobies ^1. Ces données confirment notre hypothèse que l'environnement faible en oxygène dans le compartiment apical de la VDC améliore les interactions bactéries-hôte et indique que les propriétés invasives de C. jejuni sont incrassouplies dans ces conditions. Ce fut le premier rapport de l'utilisation du modèle VDC pour étudier une bactérie pathogène invasif et souligne l'importance d'effectuer des essais d'infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la situation in vivo. Le modèle VDC pourrait être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène pour de nombreuses espèces bactériennes différentes.